检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医寄生虫病 2007年第4期15卷 11-15页

作者：杜凯李树清陈志飞周艳琴王贵强王巧全姚宝安赵俊龙华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 上海出入境检验检疫局上海200135 华中农业大学动物医学院武汉430070

目的克隆边缘无浆体MSP5基因,构建重组质粒,并进行表达与鉴定。方法根据GenBank公布的边缘无浆体MSP 5基因序列(AY714547)设计一对引物,无菌颈静脉采集边缘无浆体阳性的牛血,用PCR方法从4血的DNA模板中扩增MSP 5基因582bp的片断。将该... 详细信息

目的克隆边缘无浆体MSP5基因,构建重组质粒,并进行表达与鉴定。方法根据GenBank公布的边缘无浆体MSP 5基因序列(AY714547)设计一对引物,无菌颈静脉采集边缘无浆体阳性的牛血,用PCR方法从4血的DNA模板中扩增MSP 5基因582bp的片断。将该片段克隆到原核表达载体pGEX-KG中,构建原核表达载体KG-MSP5,转化BL21,经IPTG的诱导表达蛋白。利用BugBuster GST Bind Purification Kit将其纯化,经Western blotting进行分析。结果重组质粒KG-MSP5,转化BL21,在IPTG的诱导下表达大小约46 kPa蛋白。western blotting分析表明其具有很好的免疫原性。结论本研究为边缘无浆体的血清学诊断试剂盒的研制奠定了基础。

关键词：边缘无浆体 MSP5 原核表达纯化

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弓形虫ROP2基因在大肠杆菌内高效表达条件的优化

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长江大学学报（自科版）（中旬） 2007年第2期4卷 60-62页

作者：江涛赵年彪赵俊龙长江大学动物科学学院荆州职业技术学院生物工程系湖北荆州434100 华中农业大学动物医学院华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

采用SDS-PAGE方法检测弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白(Rhoptry protein)ROP2基因原核表达质粒在大肠杆菌BL21Codon Plus中的表达量。通过改变菌体密度、诱导剂浓度和诱导时间进行高效表达条件的优化。结果显示,在菌体密度D600nm为... 详细信息

采用SDS-PAGE方法检测弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白(Rhoptry protein)ROP2基因原核表达质粒在大肠杆菌BL21Codon Plus中的表达量。通过改变菌体密度、诱导剂浓度和诱导时间进行高效表达条件的优化。结果显示,在菌体密度D600nm为0·6、IPTG浓度为0·4mmol·L-1和诱导表达3.5h时,融合蛋白的表达量最大,达到159mg·L-1培养液。这为利用重组ROP2研究和制备弓形虫病的诊断抗原奠定基础。

关键词：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii) ROP2基因高效表达

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血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC/apxⅠA+基因缺失重组菌株的构建与鉴定

血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC/apxⅠA+基因缺失重组菌株的构建...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：刘金林林荔雯贝为成陈焕春华中农业大学动物医学院动物传染病研究室武汉湖北430070 华中农业大学动物医学院动物传染病研究室武汉湖北430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物病原分室武汉湖北430070

通过接合转移和SacB负向筛选的方法,我们构建了一株apxⅡC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株.首先构建重组转移质粒pEHA1.将pEHA1转化供体大肠杆菌β2155,并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养5小时,然后涂到含霉素抗性的培养... 详细信息

通过接合转移和SacB负向筛选的方法,我们构建了一株apxⅡC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株.首先构建重组转移质粒pEHA1.将pEHA1转化供体大肠杆菌β2155,并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养5小时,然后涂到含霉素抗性的培养基上培养,挑取阳性克隆,接种到无抗性液体培养基,培养后涂于含有蔗糖的的培养基,培养一定时间后挑取蔗糖抗性的克隆,即可得到目的突变株.通过PCR、遗传稳定性、外毒素分泌、重组位点。序列分析验证了重组菌构建成功.我们对重组菌生物学特性进行了初步研究,发现其增殖能力未受影响,对小鼠毒力显著降低.该突变株构建体系的建立为猪传染性胸膜肺炎减毒活疫苗的开发以及对胸膜肺炎放线杆菌特定基因的功能研究奠定了良好基础。

关键词：猪传染性胸膜肺炎胸膜肺炎放线杆菌接合转移负向筛选重组菌株生物学特性

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西加毒素小鼠生物学检测法的建立

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动物医学进展 2007年第10期28卷 17-22页

作者：朱海郑露王爱辉范放郭爱珍李金峰杨晓夏赵芳深圳市出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心广东深圳518067 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

旨在建立西加毒素小鼠生物学检测法。采用19 g^21 g的昆明系雄性小鼠,将一系列不同浓度的西加毒素(P-CTX-1)标准溶液通过腹腔注入小鼠体内,观察其中毒症状,确定1个鼠单位(mu)所代表的毒素剂量,并且建立剂量-中间死亡时间曲线。结果表明... 详细信息

旨在建立西加毒素小鼠生物学检测法。采用19 g^21 g的昆明系雄性小鼠,将一系列不同浓度的西加毒素(P-CTX-1)标准溶液通过腹腔注入小鼠体内,观察其中毒症状,确定1个鼠单位(mu)所代表的毒素剂量,并且建立剂量-中间死亡时间曲线。结果表明对我国昆明系雄性小鼠腹腔注射西加毒素,1个鼠单位所对应的P-CTX-1剂量值约为9.10 ng,其95%可信限为8.67 ng^9.56 ng;剂量-中间死亡时间曲线方程为y=244.9x-1.3937;其中y代表致死时间,x表剂量;将死亡时间t变为时间倒数1/t,对CTX的毒性mu取对数即logmu,得直线回归方程y=1.2076 x-0.047,R2=0.9921,其中y代表西加毒素毒性的对数(logmu),x代表小鼠死亡时间倒数(1/t),R为相关系数。同时利用该方法在0.1、0.2、0.3 ppb 3个浓度水平进行验证试验,结果表明,方法的总体平均回收率为46.58%~50.23%,相对标准偏差范围为1.17%~2.28%。

关键词：西加毒素 P-CTX-1 小鼠生物法鼠单位(mu) LD50

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一株猪源鼠伤寒沙门氏菌的耐药性鉴定及其消除

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微生物学报 2006年第5期46卷 789-795页

作者：贾爱卿刘维红郭爱珍陈焕春华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北省预防兽医学重点实验室

猪源鼠伤寒沙门氏菌临床分离株17Y,检测其对19种抗生素的耐药性,结果耐14种抗生素。用高温及高浓度SDS处理后,获得对11种抗生素的敏感性,该菌株命名为17S1。PCR检测证明,大部分耐药基因存在于质粒上,包括I型整合子携带耐药基因,且随着... 详细信息

猪源鼠伤寒沙门氏菌临床分离株17Y,检测其对19种抗生素的耐药性,结果耐14种抗生素。用高温及高浓度SDS处理后,获得对11种抗生素的敏感性,该菌株命名为17S1。PCR检测证明,大部分耐药基因存在于质粒上,包括I型整合子携带耐药基因,且随着质粒的消除而被消除。所鉴定的耐药基因有blaTEM、blaOXA-1、cat1、tet(B)、aacC2、aadA8b、dhfrXⅡ和sul1等。喹诺酮类药物的靶基因gyrA与parC位于染色体上。GyrA在耐药决定区第87位氨基酸突变(N78D),导致了喹诺酮类药物的耐药性逆转。敏感菌中扩增不到质粒毒力基因spv与rck。耐药性消除后的菌株17S1对小鼠的毒力降低(LD50增加10倍),在小鼠体内的增长与散速度也显著降低(P<0.05)。以上证据表明,鼠伤寒沙门氏菌的多重耐药性主要由质粒决定,研究开发新型质粒消除剂将对克服鼠伤寒沙门氏菌多重耐药性具有重要意义。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌耐药性质粒消除细菌毒力整合子

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特异性抑制伪狂犬病毒EP0基因表达的siRNA分子的合成与筛选

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中国病毒学 2006年第6期21卷 565-570页

作者：习杨周锐郭洪胡勤芹方六荣陈焕春华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070

EP0基因是伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)的早期基因,可能与病毒复制及潜伏感染等有关。为了筛选特异性抑制EP0基因表达的siRNA序列,本研究按照Ambion公司公布的siRNA分子设计原则,设计并合成了3个针对PRVEa株EP0基因的siRNA模板EP0... 详细信息

EP0基因是伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)的早期基因,可能与病毒复制及潜伏感染等有关。为了筛选特异性抑制EP0基因表达的siRNA序列,本研究按照Ambion公司公布的siRNA分子设计原则,设计并合成了3个针对PRVEa株EP0基因的siRNA模板EP04、EP08和EP12,分别克隆到以CMV启动子的siRNA表达载体pSilencer4.1-CMVneo中,构建相应的重组表达质粒p4.1-EP04、p4.1-EP08和p4.1-EP12。同时,将EP0基因的编码区克隆到真核表达载体pEGFP-N3中,按照读码框架与EGFP基因的5’端融合,获得重组表达质粒pEP0-EGFP。将p4.1-EP04、p4.1-EP08、p4.1-EP12和阴性对照质粒p4.1-NK分别与pEP0-EGFP共转染IBRS-2细胞,荧光显微镜观察、流式细胞仪和半定量RT-PCR检测结果表明,三个siRNA分子均能不同程度地抑制EP0基因的表达,抑制效率从高到低依次为EP08、EP12和EP04;在进一步的病毒感染实验中也得到了与细胞转染模型一致的结论。这为深入研究EP0基因在PRV复制和潜伏感染中的作用奠定了基础。

关键词： siRNA 伪狂犬病毒 EPO

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弓形虫SAGⅠ基因的克隆与原核表达

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华中农业大学学报 2006年第1期25卷 9-12页

作者：王金苹赵俊龙江涛周艳琴刘琴付媛姚宝安华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院武汉430070

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出SAGⅠ部分基因片段,亚克隆入表达载体pGEX-KG,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示表达的重组蛋白的分子量为56ku。免疫印记分析显示此表达产物能被猪抗弓形虫阳性血清... 详细信息

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出SAGⅠ部分基因片段,亚克隆入表达载体pGEX-KG,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示表达的重组蛋白的分子量为56ku。免疫印记分析显示此表达产物能被猪抗弓形虫阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有免疫反应活性。为进一步进行弓形虫病的免疫预防和诊断研究奠定了基础。

关键词：弓形虫 SAGⅠ基因基因表达基因克隆弓形虫病

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弓形虫微线体蛋白MIC3基因的克隆及原核表达

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畜牧兽医学报 2006年第6期37卷 587-591页

作者：江涛周艳琴刘琴聂浩姚宝安赵俊龙华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院武汉430070

根据编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入***5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定。... 详细信息

根据编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,克隆入pGEX-KG表达载体,转化入***5α感受态细胞,经含氨苄青霉素琼脂平板筛选,小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定。然后阳性重组质粒转化入***21-CodonPlus,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列(AJ132530)的同源性达99.6%,表达的MIC3融合蛋白表观分子量约为66 ku,且可被兔抗弓形虫免疫血清识别。说明所获得的表达蛋白质具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：龚地弓形虫 MIC3 基因克隆表达

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猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型RTX毒素I的N-端表达多肽具有良好的免疫原性

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生物工程学报 2006年第1期22卷 39-45页

作者：梅岭周锐卢海松贝为成刘维红林荔雯洪文洲陈焕春农业微生物学国家重点实验室动物病原微生物分室武汉430070 农业微生物学国家重点实验室动物病原微生物分室武汉430070 华中农业大学动物医学院武汉430070 华中农业大学动物医学院武汉430070

ApxI外毒素是猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)最重要的毒力因子,为了研究其N端多肽的免疫原性,分别将apxIA基因的全长编码区(apxIA,3146bp)及其5'端1140bp的片段(apxIA5)克隆到原核表达载体pET-28a,经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达,表... 详细信息

ApxI外毒素是猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)最重要的毒力因子,为了研究其N端多肽的免疫原性,分别将apxIA基因的全长编码区(apxIA,3146bp)及其5'端1140bp的片段(apxIA5)克隆到原核表达载体pET-28a,经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达,表达产物ApxIA和ApxIAN均以包涵体的形式存在,Westem-blot检测证实两种表达产物均具有免疫反应性.将纯化的重组蛋白(rApxIA和rApxIAN)和提取的天然毒素ApxI(nApxI)分别经腹腔免疫BALB/c小鼠,于免疫前、免疫2周和4周后分别检测了ELISA抗体和毒素中和抗体水平,结果表明,rApxIAN免疫组的ELISA抗体显著低于rApxIA免疫组和nApxI免疫组,但rApxIAN免疫组血清中和试验中测定的溶血素单位与rApxIA及天然nApxI免疫组没有显著差异.第二次免疫2周后,用1个LD50的APP血清1型J101株和2型标准菌株攻击试验动物,rApxIAN免疫组对血清1型和2型菌株的保护率分别为80%和100%.

关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxI毒素 N-端多肽原核表达免疫原性

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研究胸膜肺炎放线杆菌的流行病学方法: 分型的新方法及对未来的展望

研究胸膜肺炎放线杆菌的流行病学方法: 分型的新方法及对未来的展...

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亚洲猪病学会第三届学术会议

作者： Zhou L Rycroft AN Langford PR Jones SCP Bossé JT Angen Φ Nash JHE Zhou R Hanage WP Spratt BG Kroll JS 帝国理工大学圣玛丽学院儿科伦敦W2 1PG英国伦敦大学皇家兽医学院病理和传染病学系北麦恩赫特福郡AL9 7TA英国丹麦动物医学研究室布洛斯威27DK-1790哥本哈根丹麦加拿大国家研究委员会生命科学学院病原菌基因组研究组渥太华安大略湖K1A 0R6加拿大华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室狮子山街1号武汉 430070中国帝国理工大学圣玛丽学院传染病流行病学系伦敦W2 1PG英国

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失.分型作为当前菌株鉴定的金规则已经成为流行病学监控主要手段,为进行正确治疗,防疫疾病或实施扑灭计划提供了有用... 详细信息

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失.分型作为当前菌株鉴定的金规则已经成为流行病学监控主要手段,为进行正确治疗,防疫疾病或实施扑灭计划提供了有用的指导.胸膜肺炎放线杆菌有16种血清型(1-4,5a,5b,6-15),在不同区域流行着不同优势血清型。经典的血清分型方法是利用兔血清与不同表面多糖之间发生的免疫反应。传统的血清分型的方法包括补体结合实验,间接血凝实验,ELISA,凝集实验,乳胶凝集反应,间接荧光抗体标记技术,免疫扩散,环状沉淀试验.这些实验都有共同的缺陷:个别批次被检验的血清检验结果重复性不好,而且不同的血清型之间有着交叉反应,如在3、6、和8型之间存在交叉反应。为了避免使用免疫学方法,研究们选择了基因分型的方法,如利用多重PCR反应可以鉴定血清型为2、5、6和8型的菌株.现在本文介绍一种3型菌的特异PCR,它可以和Apx Ⅳ基因的特异PCR组合成多重PCR.其他用于流行病学和的鉴定研究方法还有核糖分型,核糖体基因间区域序列分析,脉冲场凝胶电泳,限制酶切指纹,aroA基因PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP),16S RNA的序列分析,RAPD分析和脉冲场凝胶电泳等等。目前,通过分析表达了ApxⅠ-Ⅲ和外膜蛋白OmlA的基因已经用于基因分型。然而通过己发表的三篇论文对胸膜肺炎放线杆菌进行多位点。酶电泳分析(MLEE)研究,可以推测多位点。序列分析(MLST)将会是这种重要病原菌在流行病学和进化研究中的一个有用的工具.MLST包含互不相邻而分散于基因组中可能和免疫选择相关的7个看家基因的DNA序列.MLST不同与传统实验室技术所产生的含糊数据,它可以通过互联网与全世界其他实验室快速分享数据。通过检测从丹麦,中国和英国分离菌株所得到的前期数据显示:MLST在血清分型上更清晰确切,而且在流行病学研究和从微观(动物)与宏观(所有生物)上理解胸膜肺炎放线杆菌的进化都显示出了重要性。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌流行病学多位点酶电泳分析

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