牛结核病是严重危害我国奶牛养殖业和人类食品安全的B类传染病,2001年和2002年的部分统计结果表明我国个别省市奶牛结核病阳性率高达10%以上。当前我国牛结核病的诊断主要靠传统的牛PPD(Purified protein deprived bovine)皮试法进行检...
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牛结核病是严重危害我国奶牛养殖业和人类食品安全的B类传染病,2001年和2002年的部分统计结果表明我国个别省市奶牛结核病阳性率高达10%以上。当前我国牛结核病的诊断主要靠传统的牛PPD(Purified protein deprived bovine)皮试法进行检测,但是由于PPD成份复杂,特异性易受其他分支杆菌影响而出现假阳性,同时敏感性也较低,诊断效果不佳,造成我国"检疫-扑杀"政策实施效果大打折扣。目前国际上诊断试剂的研究趋势是使用成分明确的抗原蛋白代替PPD进行牛结核病诊断。MPB70是一种牛分枝杆菌特异性分泌蛋白质,分泌量占培养基蛋白总量10%,是分枝杆菌感染过程中重要的体液和细胞免疫目标抗原。国外利用MPB70开发出的牛结核病免疫荧光偏振测定(FPA)诊断方法敏感性和特异性高达92.9%和98.3%。MPB83是与MPB70是非常相似的同源蛋白质,亦是***体外高效表达抗原,但其一部分分泌到培养基中,另一部分结合在细胞壁上。MPB83是被***感染的牛血清中主要的抗原之一,能很好地被T细胞识别,据报道能够很好地区分出感染牛和BCG免疫接种牛。本研究为研究新型牛结核病诊断试剂,克隆并表达了牛分枝杆菌特异性抗原蛋白质MPB70和MPB83并进行了其免疫活性研究。根据Genbank发表的牛分枝杆菌标准株序列设计两对特异性引物,从牛分枝杆菌临床分离株基因组中扩增出mpb70和mpb83基因片段,亚克隆进入原核表达载体pET28a(+)中,经酶切和序列测定验证其正确性。在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导其表达,发现MPB70和MPB83蛋白质均可被诱导大量表达且以包涵体形式存在。从包涵体中提纯获得mg数量级MPB70和MPB83蛋白质。初步用于酶联免疫吸附反应方法,并进一步优化反应条件,通过检测近百份新鲜牛奶和奶牛血清样品,检出部分样品为阳性,和其他检测方法(如PPD-ELISA检测)结果有80%-100%的符合率,包括MPB70和MPB83-ELISA在内的血清学方法和皮内变态反应相比,有一定的符合率,但也有一定比例的差异。据此结果推断,本研究所表达的牛分枝杆菌特异性蛋白质MPB70和MPB83均具有免疫活性,并有希望用于牛结核病的诊断,特别是有可能用于检验牛奶,对监视结核病及保障食品安全发挥作用,其原核表达系统及ELISA方法的建立为进一步研制牛结核病特异性诊断试剂奠定了基础,可能对我国人畜结核病疫情控制起到重要作用。
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