检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2025年第2期56卷 860-869页

作者：李枝卉罗金林谢虹李明坤林杨张宇姣徐引弟陈焕春蔡旭旺徐晓娟华中农业大学动物医学院农业微生物资源发掘与利用重点实验室湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070 河南省农业科学院畜牧兽医研究所郑州450002

本研究旨在增加副猪格拉瑟菌寡肽渗透酶(oligopeptide permease,OppA)表达量,构建可以过表达OppA的副猪格拉瑟菌株,并对其进行小鼠的免疫保护试验以评价其作为格拉瑟病弱毒活疫苗的潜力。以副猪格拉瑟菌CF7066株为亲本株,利用自然转化和... 详细信息

本研究旨在增加副猪格拉瑟菌寡肽渗透酶(oligopeptide permease,OppA)表达量,构建可以过表达OppA的副猪格拉瑟菌株,并对其进行小鼠的免疫保护试验以评价其作为格拉瑟病弱毒活疫苗的潜力。以副猪格拉瑟菌CF7066株为亲本株,利用自然转化和Flp-FRT无抗突变系统构建副猪格拉瑟菌OppA过表达株,通过Western blot检测OppA的表达量,通过阿拉伯糖诱导和提高培养温度消除抗性基因和Flp表达质粒。进行小鼠免疫保护试验,通过检测血清中抗体水平及脾淋巴细胞增殖、观察小鼠死亡率。结果显示:构建了3株副猪格拉瑟菌OppA过表达株ΔnanH::oppA^(R),ΔnanH::oppA和ΔnanH::P qseB-oppA。由于ΔnanH::oppA^(R)株中OppA的表达量显著高于CF7066(P<0.001),所以选择该过表达株进行小鼠免疫保护试验。小鼠在免疫后进行rOppA-ELISA的抗体检测,结果表明,ΔnanH::oppA^(R)免疫组的OppA抗体水平比CF7066组、ΔnanH组和PBS组高,但低于灭活疫苗组。用rOppA蛋白刺激脾淋巴细胞,ΔnanH::oppA^(R)和CF7066组小鼠脾淋巴细胞的增殖量显著高于刺激前(P<0.05),而ΔnanH、灭活疫苗组和PBS对照组没有改变。用CF7066菌株进行攻毒,其中灭活疫苗组、ΔnanH::oppA^(R)组、CF7066组对小鼠的保护率均为100%,ΔnanH组为75%。当前研究构建的3株副猪格拉瑟菌重组菌株中,ΔnanH::oppA^(R)的OppA表达水平最高,用该菌株免疫小鼠后产生OppA特异性的体液免疫和细胞免疫,而且可对CF7066攻毒提供有效保护。基于此,副猪格拉瑟菌OppA过表达株ΔnanH::oppA^(R)有望作为副猪格拉瑟菌的减毒活疫苗。

关键词：副猪格拉瑟菌寡肽渗透酶过表达基因工程弱毒疫苗

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表达绿色荧光蛋白突变体的重组伪狂犬病毒的构建及其增殖特性

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第6期34卷 757-762页

作者：方六荣陈焕春肖少波张辉牛传双华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒研究室武汉430070 华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒研究室

将绿色荧光蛋白突变体M 1(EGFPS14 7/P)基因融合到伪狂犬病毒 (PRV)非必需糖蛋白 gG的第 8个氨基酸下游 ,通过同源重组、空斑纯化和PCR筛选获得能表达M 1并导致gG基因部分缺失的重组病毒 gG-/M1+ 。重组病毒经Southern杂交、Western印... 详细信息

将绿色荧光蛋白突变体M 1(EGFPS14 7/P)基因融合到伪狂犬病毒 (PRV)非必需糖蛋白 gG的第 8个氨基酸下游 ,通过同源重组、空斑纯化和PCR筛选获得能表达M 1并导致gG基因部分缺失的重组病毒 gG-/M1+ 。重组病毒经Southern杂交、Western印迹和荧光观察证实构建正确。纯化的重组病毒以低感染指数接种PK 15细胞 ,在感染早期 (6h)就能观察到荧光 ,随着病毒的增殖 ,荧光逐渐增强 (2 4～ 36h) ,直至完全病变 ,荧光淬灭。进一步对重组病毒gG-/M1+ 与亲本株gG-/LacZ+ 、野毒株的增殖特性进行比较 ,发现 3种毒株在增殖滴度上无显著差异。上述结果表明构建的PRVgG-/M1+ 突变株能作为活细胞示踪实时监测病毒感染的动态分析。

关键词：伪狂犬病毒绿色荧光蛋白突变体标记增殖特性

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伪狂犬病毒gI基因的克隆表达及其对病毒增殖的影响

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微生物学报 2002年第3期42卷 281-287页

作者：肖少波方六荣王革非陈焕春洪文洲华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉430070

从伪狂犬病毒 (PRV)国内地方分离Ea株基因组DNA片段中克隆了完整的gI基因 ,序列分析结果表明 ,gI基因编码区全长 1 1 0 1bp ,可编码 3 6 6个氨基酸残基 ,二级结构预测具有典型I型膜蛋白特征。与GenBank中收录的国外Rice株的同源比较发现... 详细信息

从伪狂犬病毒 (PRV)国内地方分离Ea株基因组DNA片段中克隆了完整的gI基因 ,序列分析结果表明 ,gI基因编码区全长 1 1 0 1bp ,可编码 3 6 6个氨基酸残基 ,二级结构预测具有典型I型膜蛋白特征。与GenBank中收录的国外Rice株的同源比较发现 ,Ea株gI在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处突变 ,尤其是潜在胞浆区中连续两个碱基的缺失导致移码突变 ,致使gI基因的读码框架后移 ,从而导致Ea株gI较rice株长 1 6个氨基酸残基。将gI基因克隆到真核表达载体pcDNA3 1 +中的人巨细胞病毒早期启动子下游 ,构建的真核表达质粒转染PK 1 5细胞 ,间接免疫荧光检测证实gI获得正确表达。进一步测定天然缺失gI的PRV弱毒Bartha株在表达gI细胞系和空白载体转染的对照细胞系中的蚀斑形成单位 (pfu)和组织细胞培养半数感染量 (TCID50 ) ,结果显示 :Bartha株在表达gI细胞系中的pfu和TCID50 分别为对照细胞系的 1 6 4 %和 2 0 0 %。

关键词：伪狂犬病毒 gI基因克隆表达病毒增殖序列分析体外表达动物病毒

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表达猪γ干扰素的重组腺病毒的构建和活性鉴定

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病毒学报 2007年第5期23卷 394-398页

作者：姚清侠徐卓菲何雁南司有辉钱平陈焕春华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉430070

以刀豆素A(ConA)诱导的梅山猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆扩增出全长猪γ干扰素基因(PoIFNγ,501bp)。测序结果证实扩增得到的PoIFNγ与GenBank上所报道的猪γ干扰素基因同源性为100%。将PoIFNγ插入腺病毒... 详细信息

以刀豆素A(ConA)诱导的梅山猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆扩增出全长猪γ干扰素基因(PoIFNγ,501bp)。测序结果证实扩增得到的PoIFNγ与GenBank上所报道的猪γ干扰素基因同源性为100%。将PoIFNγ插入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组。在293A包装细胞系中成功包装成完整的病毒粒子。将此重组后的腺病毒连续接种传至第10代,每代提取病毒基因组,PCR均能扩增出目的片段,以细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性达1.3×106U/mL,证明该种表达猪γ-干扰素的重组腺病毒能稳定传代。

关键词：猪γ-干扰素克隆序列分析腺病毒

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携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达

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微生物学报 2007年第1期47卷 141-144页

作者：姚清侠刘新文钱平郭东春陈焕春华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉430070

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上... 详细信息

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。

关键词：猪γ干扰素逆转录病毒 PA317细胞 PK-15细胞表达抗病毒活性水泡性口炎病毒口蹄疫病毒

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猪IL-2与IL-6的原核表达及其对伪狂犬病基因缺失疫苗的佐剂效应研究

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中国农业科学 2003年第10期36卷 1213-1218页

作者：严琳何启盖陈焕春肖少波吴美洲吕建强韩丽华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉 430070

将猪白细胞介素2(pIL-2)与猪白细胞介素6(pIL-6)的cDNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a及pGEX-KG上,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导产生重组蛋白pIL-2与pIL-6,表达量分别占菌株总蛋白的43.45％和28.37％,经提纯后含量可分别达到97.0... 详细信息

将猪白细胞介素2(pIL-2)与猪白细胞介素6(pIL-6)的cDNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a及pGEX-KG上,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导产生重组蛋白pIL-2与pIL-6,表达量分别占菌株总蛋白的43.45％和28.37％,经提纯后含量可分别达到97.06％和86.37％。将提纯后不同剂量的两种重组蛋白以单独或组合的方式,加入伪狂犬病(Ea株)TK~-/gG~-双基因缺失疫苗中,使每头份疫苗分别含2、5和10μg·ml-1的pIL-2或(和)pIL-6,用此疫苗免疫伪狂犬病抗体阴性猪。同时设试验对照组。初次免疫30d后加强免疫,测定中和抗体,观察试验猪的日增重情况,进行统计分析。发现各试验组的抗体水平均高于不含重组蛋白的基因缺失疫苗组;其中,含2μg·ml-1pIL-2试验组与含10μg·ml-1pIL-2/pIL-6试验组抗体水平和基因缺失疫苗对照组之间呈显著差异(P=0.019)与极显著差异(P=0.009)。结果表明,大肠杆菌表达的pIL-2、pIL-6对伪狂犬病鄂A株基因缺失疫苗(TK~-/gG~-/LacZ~+)有较强的佐剂效应,且呈剂量相关性。不同试验组日增重比较结果表明,免疫效果高低与猪的生长速度呈正相关。本试验为重组pIL-2与pIL-6作为新型疫苗佐剂应用提供了重要的试验依据。

关键词：猪白细胞介素2 猪白细胞介素6 表达伪狂犬病鄂A株基因缺失疫苗佐剂

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猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA基因的克隆、序列分析及原核表达

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微生物学报 2003年第3期43卷 324-329页

作者：陈汉阳刘军发何启盖肖少波陈焕春华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉430070

因胸膜肺炎放线杆菌的致病性主要是由毒素决定的 ,故参照猪胸膜肺炎放线杆血清2型菌株的序列 (GenBankL1 2 1 4 5)设计了一对特异性引物 ,用PCR的方法扩增apxⅢA基因并得到了长 3 466bp的片段 ,然后将其克隆到pMD 1 8T中 ,经酶切鉴定和... 详细信息

因胸膜肺炎放线杆菌的致病性主要是由毒素决定的 ,故参照猪胸膜肺炎放线杆血清2型菌株的序列 (GenBankL1 2 1 4 5)设计了一对特异性引物 ,用PCR的方法扩增apxⅢA基因并得到了长 3 466bp的片段 ,然后将其克隆到pMD 1 8T中 ,经酶切鉴定和序列分析表明克隆是成功的 ;再将apxⅢA插入到原核表达载体pET 2 8b后 ,转化BL2 1 (DE3) ,在IPTG诱导下获得高效表达 ,经Westernblotting检测证实表达产物有活性。以表达产物包被ELISA板 ,建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。

关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA基因克隆序列分析原核表达

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伪狂犬病病毒Ea株gE基因主要抗原区在巴斯德毕赤酵母中的表达

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微生物学报 2002年第5期42卷 543-549页

作者：覃雅丽陈焕春唐勇何启盖徐引弟华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉430070

伪狂犬病病毒gE蛋白是一种重要的诊断抗原 ,可用于伪狂犬病根除计划中的鉴别诊断。为了获得大量的抗原 ,将编码gE主要抗原区域的基因片段插入毕赤酵母表达载体中 ,得到的重组表达载体转化GS1 1 5酵母 ,通过G41 8抗性筛选得到一株多拷贝... 详细信息

伪狂犬病病毒gE蛋白是一种重要的诊断抗原 ,可用于伪狂犬病根除计划中的鉴别诊断。为了获得大量的抗原 ,将编码gE主要抗原区域的基因片段插入毕赤酵母表达载体中 ,得到的重组表达载体转化GS1 1 5酵母 ,通过G41 8抗性筛选得到一株多拷贝的重组酵母 ,经甲醇诱导表达了截短的gE蛋白 ,并分泌到胞外。Westernblotting分析显示表达的蛋白大小为3 3kD。ELISA结果表明表达蛋白具有良好的抗原性 ,重组酵母的诱导培养上清不需纯化可直接作为抗原检测gE的抗体。

关键词：伪狂犬病病毒 Ea株 gE基因抗原区巴斯德毕赤酵母表达

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猪细小病毒VP_2蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性

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微生物学报 2002年第6期42卷 675-679页

作者：吕建强陈焕春赵俊龙肖少波王革非华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉430070

将猪细小病毒 (PorcineParvovirus,PPV)vp2 基因重组到杆状病毒Bac To Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中 ,构建了pFast vp2 质粒。在DH10 Bac大肠杆菌中 ,pFast vp2 与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒 (AcNPV)基因组 (Bacmid)发生同源重... 详细信息

将猪细小病毒 (PorcineParvovirus,PPV)vp2 基因重组到杆状病毒Bac To Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中 ,构建了pFast vp2 质粒。在DH10 Bac大肠杆菌中 ,pFast vp2 与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒 (AcNPV)基因组 (Bacmid)发生同源重组 ,从而获得重组穿梭载体Bac mid vp2 ,转染Sf9细胞得到重组病毒AcNPV vp2 。SDS PAGE和Western blotting分析可见大小约为 6 4kD的特异性带 ,表明AcNPV vp2 在Sf9细胞中成功地表达了PPVVP2 蛋白。红细胞凝集试验和间接ELISA进一步证实 ,表达的VP2 蛋白具有与全病毒相同的血凝活性和相似的抗原性。电镜观察VP2 蛋白的粗提物 ,发现VP2 蛋白可自行装配成许多病毒样粒子 (VLPs)

关键词：猪细小病毒 VP2蛋白昆虫细胞表达病毒样粒子

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伪狂犬病病毒gC基因在IBRS-2细胞中的表达及其对病毒繁殖的影响

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中国生物化学与分子生物学报 2001年第2期17卷 198-202页

作者：肖少波陈焕春方六荣洪文洲何启盖华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室武汉430070

对含伪狂犬病病毒 Ea株 g C全基因的质粒 p UC1 .75进行亚克隆 ,将其完整编码区置于真核表达载体 pc DNA3.1 +的 HCMV启动子 /增强子下游 ,构建了 g C基因真核表达质粒 pc DNA-g C.脂质体转染 IBRS- 2细胞 ,在 G41 8抗性选择下 ,获得多... 详细信息

对含伪狂犬病病毒 Ea株 g C全基因的质粒 p UC1 .75进行亚克隆 ,将其完整编码区置于真核表达载体 pc DNA3.1 +的 HCMV启动子 /增强子下游 ,构建了 g C基因真核表达质粒 pc DNA-g C.脂质体转染 IBRS- 2细胞 ,在 G41 8抗性选择下 ,获得多个阳性克隆细胞系 .经 ELISA筛选反应最强的阳性克隆细胞系 ,进一步用间接免疫荧光检测证实 g C基因在 IBRS- 2细胞中得到了正确表达并分布在细胞膜 .以 1 0 0个蚀斑形成单位的伪狂犬病病毒分别接种表达 g C的细胞系和空白载体转染细胞系 .通过测定蚀斑数发现 ,表达 g C的细胞系对病毒的感染具有抑制作用 ,平均抑制率达 59.4%± 1 .3% .

关键词：伪狂犬病病毒抑制吸附 gC基因表达 IBRS-2细胞

来源：评论

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