检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2005年第1期21卷 30-35页

作者：黄巍李凌波韩玲张慧杨渝珍华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系武汉430030

肿瘤坏死因子转换酶 (TACE)是加工裂解TNF α前体的关键酶 ,参与了许多炎症的发生发展过程。为通过肽库筛选得到TACE的抑制肽 ,首先制备筛选靶分子 ,用RT PCR从人外周血单核细胞中分别扩增出TACE的催化区 (T80 0 )和整个胞外区 (T130 0 ... 详细信息

肿瘤坏死因子转换酶 (TACE)是加工裂解TNF α前体的关键酶 ,参与了许多炎症的发生发展过程。为通过肽库筛选得到TACE的抑制肽 ,首先制备筛选靶分子 ,用RT PCR从人外周血单核细胞中分别扩增出TACE的催化区 (T80 0 )和整个胞外区 (T130 0 ) ,然后分别克隆至pET 2 8a和pET 2 8c中 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达出带有His tag的目的蛋白 ,两者均为包涵体 ,变性复性后过Ni2 + NTA亲和层析柱得到纯度达 90 %的重组蛋白。以纯化的重组T80 0和T130 0分别筛选噬菌体展示随机 15肽库 ,对筛选克隆进行ELISA检测、竞争抑制实验和序列分析。从两个独立的筛选过程中得到一个相同的阳性克隆序列“TRWLVYFSRPYLVAT” ,固相Fmoc法合成该短肽 ,观察其在LPS诱导人单核细胞产生sTNF α中的作用。结果表明 ,筛选到的短肽可显著抑制TACE的活性 ,减少TNF α的分泌 ,抑制率可达 6 0 3% ,为抗炎小分子药物的设计和改造提供线索和依据。

关键词：肿瘤坏死因子转换酶胞外功能域噬菌体展示抑制肽

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Hsp70-H22肿瘤抗原肽复合物激活树突状细胞诱导抗肿瘤免疫的研究

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中华肿瘤杂志 2002年第5期24卷 421-425页

作者：黄波冯作化张桂梅李东王洪涛华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系武汉430030

目的　探讨通过树突状细胞 (DC)提呈途径降低肿瘤抗原肽用量的可行性 ,了解热休克蛋白 70 (Hsp70 )和抗原肽修饰DC作用的特点。方法　以Hsp70于体外结合抗原肽 ,并于体外修饰DC ,检测修饰后DC的代谢活性及分泌的细胞因子 ;比较修饰后DC... 详细信息

目的　探讨通过树突状细胞 (DC)提呈途径降低肿瘤抗原肽用量的可行性 ,了解热休克蛋白 70 (Hsp70 )和抗原肽修饰DC作用的特点。方法　以Hsp70于体外结合抗原肽 ,并于体外修饰DC ,检测修饰后DC的代谢活性及分泌的细胞因子 ;比较修饰后DC和Hsp70 H2 2肽对淋巴细胞的激活作用 ;检测激活的淋巴细胞对H2 2瘤细胞的细胞毒作用以及注射DC和Hsp70 H2 2肽对小鼠肿瘤的抑制作用。结果　Hsp70结合 0 .15 μgH2 2肽可使 2× 10 5DC成熟 ,4× 10 3 成熟DC可激活 2× 10 6淋巴细胞 ;Hsp70结合 0 .0 0 3μg肽修饰的DC或Hsp70结合 0 .15 μg肽直接刺激 ,可激活相同数量的淋巴细胞 ,产生同样的杀瘤效果。激活DC后再回输的治疗方式与直接注射Hsp70 肽复合物的治疗方式相比 ,抗原肽的用量可以降低 5 0倍。正常肝组织来源的混合肽结合Hsp70后 ,不能使DC成熟 ,亦不能通过DC途径活化脾淋巴细胞。结论　DC提呈抗原肽激活淋巴细胞的途径能够有效降低Hsp70 肿瘤抗原肽复合物使用剂量。正常细胞的混合肽不能通过Hsp70和DC提呈激活淋巴细胞。

关键词： Hsp70-H22肽复合物淋巴细胞树突状细胞肿瘤免疫学

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重组多肽CH50抑制肿瘤细胞侵袭生长和血管形成能力

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中华肿瘤杂志 2006年第11期28卷 815-819页

作者：于智睿张桂梅李东刘毅耿辉肖晗吴丰华冯作化华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系武汉430030

目的观察纤连蛋白重组多肽CH50对小鼠肝癌细胞侵袭和肿瘤血管形成能力的影响,探讨CH50多肽治疗肿瘤可能的分子机制。方法接种H22肝癌细胞建立小鼠肿瘤模型,采用裸DNA-尾静脉注射方法在小鼠体内表达CH50多肽,进行基因治疗。HE染色观察治... 详细信息

目的观察纤连蛋白重组多肽CH50对小鼠肝癌细胞侵袭和肿瘤血管形成能力的影响,探讨CH50多肽治疗肿瘤可能的分子机制。方法接种H22肝癌细胞建立小鼠肿瘤模型,采用裸DNA-尾静脉注射方法在小鼠体内表达CH50多肽,进行基因治疗。HE染色观察治疗后肿瘤细胞侵袭能力和血管形成的改变；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和明胶电泳检测肿瘤组织边缘基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA和蛋白表达及活性；体外培养H22细胞,检测CH50多肽对相关基因表达和细胞黏附能力的影响。结果小鼠体内非定位转染表达CH50多肽,对肿瘤生长具有明显的抑制作用,接种后第16天,治疗组瘤重为(0．78±0．18)g,低于质粒对照组和空白对照组(P＜0．05)；从组织水平观察,CH50多肽治疗导致肿瘤细胞大量坏死,可抑制肿瘤细胞侵袭生长和肿瘤血管生成,抑制肿瘤血管建立侧支循环。pCH510治疗组的肿瘤边缘组织中,活性型MMP-9的含量为3．2±0．7,显著低于空白对照组和质粒对照组,且活性型MMP-9占总MMP-9的比例也显著降低,是空白对照组和质粒对照组的1/4左右,但对MMP-9 mRNA表达没有明显影响。CH50多肽可下调H22细胞的αv、β3、cdc2基因的表达水平,降低H22细胞整合素αvβ3的活性。结论CH50多肽可以通过影响MMP-9和整合素αvβ3的功能起到抑制肿瘤生长、侵袭和肿瘤血管形成的作用。

关键词： CH50多肽基质金属蛋白酶-9 整合素αvβ3

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大肠杆菌-分枝杆菌分泌型穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65的构建及人结核杆菌HSP65的表达

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生物工程学报 2004年第2期20卷 170-174页

作者：戴五星陈智浩高红黄海浪梁靓程继忠皇甫永穆华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系武汉430030

用PCR技术从BacillusCalmette gu啨ｒｉｎ(BCG)基因组中扩增出抗原 85B(Ag85B)的信号肽 (SP)DNA序列 ,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下... 详细信息

用PCR技术从BacillusCalmette gu啨ｒｉｎ(BCG)基因组中扩增出抗原 85B(Ag85B)的信号肽 (SP)DNA序列 ,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建成分泌型原核穿梭表达质粒 (pBCG SP HSP65)。酶切鉴定、PCR和测序分析结果均表明分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP65构建成功。利用电穿孔将该质粒转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterialsmegmatis,MS)中 ,用卡那霉素筛选出阳性重组子。经热诱导后用SDS PAGE观察到在耻垢分枝杆菌中 65kD蛋白占总蛋白的 2 0 % ,而在重组耻垢分枝杆菌表达的 65kD蛋白占菌体总蛋白的 3 4 46% ,占裂解物上清总蛋白的 68 56% ,表明重组的HSP65基因能在耻垢分枝杆菌中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Western blot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合 ,说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性。

关键词：大肠杆菌分枝杆菌分泌型穿梭表达质粒信号肽结核轩菌HSP65 人

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静脉注射41BBLGFP融合表达质粒体内表达及其生物学活性

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中国生物化学与分子生物学报 2005年第4期21卷 482-487页

作者：邱惠张桂梅张慧袁野李东冯作化华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系

通过RTPCR方法扩增小鼠41BBLcDNA,以pEGFPN1为载体,构建融合蛋白41BBLGFP重组表达质粒p41BBLGFP.采用基于流体力学原理建立的裸DNA体内转染技术,从小鼠尾静脉快速(15s)注射质粒p41BBLGFP进行体内转染.荧光显微镜观察组织切片,见小鼠肝... 详细信息

通过RTPCR方法扩增小鼠41BBLcDNA,以pEGFPN1为载体,构建融合蛋白41BBLGFP重组表达质粒p41BBLGFP.采用基于流体力学原理建立的裸DNA体内转染技术,从小鼠尾静脉快速(15s)注射质粒p41BBLGFP进行体内转染.荧光显微镜观察组织切片,见小鼠肝、脾、肾及肺中均有报告基因GFP表达,尤以肝细胞中荧光最强.进一步用Western印迹和免疫组织化学染色法确定肝细胞表面表达41BBL,用Hsp70H22细胞抗原肽皮下免疫小鼠,同时尾静脉注射质粒p41BBLGFP,检测血清中IL2和IFNγ的分泌.结果显示,质粒注射联合免疫组小鼠血清IL2和IFNγ的浓度分别较生理盐水对照组增加了3倍和4倍;脾细胞对H22细胞的杀伤率则由单独免疫组的45.74%±3.27%增至86.74%±9.36%.结果表明,体内(主要在肝脏)转染质粒p41BBLGFP可以成功表达,表达产物具有41BBL的生物学活性,为进一步研究体内转染41BBL用于基因治疗奠定了基础.

关键词： 4-1 BBL GFP 融合蛋白静脉注射体内表达

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褪黑素对小鼠肝癌H22细胞抗增殖和促凋亡的p53依赖性机制研究

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癌症 2004年第7期23卷 803-807页

作者：佘美华陈蓓蓓王西明何善述华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系湖北武汉430030

背景与目的本室已经证明了褪黑素(melatonin,MLT)对小鼠肝癌H22细胞的生长具有抑制作用,本研究旨在探讨其机理。方法(1)建立荷瘤小鼠模型并给予褪黑素处理,取肿瘤组织进行p53、cyclinE水平的免疫组化分析;(2)不同浓度褪黑素体外培养小... 详细信息

背景与目的本室已经证明了褪黑素(melatonin,MLT)对小鼠肝癌H22细胞的生长具有抑制作用,本研究旨在探讨其机理。方法(1)建立荷瘤小鼠模型并给予褪黑素处理,取肿瘤组织进行p53、cyclinE水平的免疫组化分析;(2)不同浓度褪黑素体外培养小鼠肝癌H22细胞,采用流式细胞技术(flowcytometry,FCM)检测细胞周期分布和凋亡率;免疫组化法分析培养细胞的p53和cyclinE的蛋白水平;采用RT-PCR方法检测FasmRNA的水平。结果(1)FCM显示褪黑素可引起H22细胞G0/G1期比例升高,从75.24%上升至85.46%,同时细胞凋亡增多,从5.07%升至12.77%;(2)褪黑素作用后p53水平较对照组增高42.5%(培养细胞)和19.5%(肿瘤组织),而cyclinE的水平则降低31.7%(培养细胞)和39.9%(肿瘤组织);(3)RT-PCR结果显示FasmRNA水平增高44.2%。结论MLT通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡抑制H22细胞增殖。其机理可能是通过p53抑制下游的cyclinE的表达,阻止细胞进入S期;同时又通过p53上调Fas表达,从而诱导细胞凋亡。

关键词：褪黑素 H22细胞株 p53 cyclin E Fas

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肿瘤组织中Tim-3表达的特征及其在肿瘤免疫耐受中的作用

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第4期21卷 403-407页

作者：朱汉钢冯作化耿辉张桂梅华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系湖北武汉430030

目的:研究小鼠肿瘤发生早期两型含T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域的分子3(Tim3)的表达特点,以及与免疫调节相关基因表达的时空关系,并探讨其在诱导肿瘤免疫耐受中的作用。方法:建立小鼠实体瘤模型,采用RTPCR法检测肿瘤组织中可溶型Tim3(... 详细信息

目的:研究小鼠肿瘤发生早期两型含T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域的分子3(Tim3)的表达特点,以及与免疫调节相关基因表达的时空关系,并探讨其在诱导肿瘤免疫耐受中的作用。方法:建立小鼠实体瘤模型,采用RTPCR法检测肿瘤组织中可溶型Tim3(sTim3)和膜型Tim3(flTim3),以及叉头盒P3(forkheadboxP3,Foxp3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关受体(GITR)、TGFβ、IL10和IFNγ等在不同时相的表达及相应时相肿瘤的生长情况。结果:在早期的肿瘤组织中,sTim3的表达先于flTim3,其后flTim3大量表达,而sTim3的表达则下调直至消失。Foxp3和GITR随flTim3同时表达并逐步上调。CTLA4的表达先于flTim3,并随着时间的推移表达上调。flTim3同Foxp3的表达具有空间位置的一致性。flTim3、Foxp3和CTLA4的表达水平同肿瘤的生长呈正相关。结论:随着肿瘤不断的生长,肿瘤局部的免疫应答逐渐趋向于负调节。flTim3在诱导肿瘤免疫耐受的过程中发挥着重要作用,而sTim3可能起着不同的作用。

关键词： sTim-3 flTim-3 肿瘤免疫耐受

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可溶性PD-1协同HSP70-肽复合物抑制荷瘤小鼠肝癌的研究

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细胞与分子免疫学杂志 2004年第6期20卷 655-658页

作者：王小红张桂梅贺宇飞张慧冯作化华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系湖北武汉430030

目的 :研究基因转染和表达的可溶性PD 1(solubleprogrammeddeath 1,sPD 1)对HSP70 肽疫苗抗肿瘤效果的影响及协同机制。方法 :以HSP70 肽疫苗免疫BALB/c小鼠后 ,用半定量RT PCR技术检测和分析HSP70 肽疫苗对小鼠脾细胞上PD 1及其配... 详细信息

目的 :研究基因转染和表达的可溶性PD 1(solubleprogrammeddeath 1,sPD 1)对HSP70 肽疫苗抗肿瘤效果的影响及协同机制。方法 :以HSP70 肽疫苗免疫BALB/c小鼠后 ,用半定量RT PCR技术检测和分析HSP70 肽疫苗对小鼠脾细胞上PD 1及其配体基因表达的影响。体内转染表达sPD 1,用MTT比色法检测HSP70 肽疫苗免疫小鼠对肿瘤生长的抑制作用以及脾淋巴细胞的细胞毒活性。结果 :单独的sPD 1就有抗肿瘤效应。HSP70 肽疫苗不仅能预先在动物体内诱导肿瘤特异性的CTL ,而且可使脾细胞上抑制性共刺激受体PD 1及其配体的表达显著升高。用sPD 1与HSP70 肽疫苗联合治疗荷瘤小鼠 ,能提高脾CTL的杀伤效率并延长HSP70 肽疫苗的免疫效果。结论 :sPD 1可通过阻断PD 1与其配体的结合作用 ,及减弱PD 1的负反馈抑制作用 ,而增强HSP70

关键词：共刺激分子 PD-1 B7-H1 HSP70-肽复合物

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三类TACE抑制剂的作用机理探讨

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中国免疫学杂志 2003年第11期19卷 752-756页

作者：朱孔黎杨渝珍韩玲王震丁廷波华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系

目的 :以脂多糖 (LPS)刺激的HL 6 0细胞系为天然模型 ,筛选肿瘤坏死因子α转换酶的抑制剂 ,为人工干预炎症过程提供依据和手段。方法 :分时相刺激HL 6 0细胞后 ,用分子生物学和细胞学技术在蛋白质和mRNA水平上研究TACE表达和活性的改变... 详细信息

目的 :以脂多糖 (LPS)刺激的HL 6 0细胞系为天然模型 ,筛选肿瘤坏死因子α转换酶的抑制剂 ,为人工干预炎症过程提供依据和手段。方法 :分时相刺激HL 6 0细胞后 ,用分子生物学和细胞学技术在蛋白质和mRNA水平上研究TACE表达和活性的改变。结果 :中药热毒清 (RDQ)能明显降低LPS诱导的TACEmRNA增加 (与对照组比 ,P <0 .0 1) ;针对TACEmRNA的反义寡核苷酸 (anti ODN)在翻译水平上抑制TACE表达 ,抑制率达 78.9% ;化学合成的针对TACE催化域的小分子底物模拟肽可抑制LPS诱导的TACE表达增加 ,从而抑制sTNFα分泌增加 ,削弱LPS诱发的炎性病理反应强度。结论 :3种不同类型的抑制 (RDQ、anti ODN、底物模拟肽 )在不同层次上调节TACE的表达 ,最终均抑制了sTNFα的分泌 ,为控制炎症提供了明确的治疗靶标。

关键词：肿瘤坏死因子α 肿瘤坏死因子α转换酶反义寡核苷酸热毒清小分子类肽抑制剂 TACE抑制剂作用机理

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消化后片段长度差异等位基因特异性PCR技术——印记SNP rs220028多态性和甲基化模式研究

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中华医学遗传学杂志 2005年第1期22卷 58-60页

作者：赵贵森黄代新冯文芳杨庆恩华中科技大学同济医学院法医学系武汉430030 华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系武汉430030

目的建立一种能同时分析甲基化和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)的新方法。方法以印记SNPrs220028(A/G)为例,基因组DNA经甲基化敏感限制酶消化后用片段长度差异等位基因特异性PCR(fragmentlengthdiscrepantallele-specificPCR,FLDAS-PCR)分型;用扩增产物酶消化法来排除酶切位点序列变异,证实检出的是甲基化等位基因。结果消化后FLDAS-PCR可选择性检出甲基化等位基因,家系分析表明其来自母亲。等位基因频率A=0.5085,G=0.4915,多态信息含量为0.3749。结论消化后FLDAS-PCR技术可以实现甲基化和SNP的复合分析;印记SNPrs220028在Prader-Willi/Angelman综合征诊断中有潜在意义。

关键词：甲基化 SNP 等位基因检出特异性 PCR技术诊断酶切位点片段 PCR)

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