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RNAi介导Caspase-3基因及其抑制LPS诱导肾脏上皮细胞凋亡的研究

中国免疫学杂志 2008年第1期24卷 16-19页

作者：张艳陈栋贡福盛刘健刘晓晴华中科技大学同济医学院附属同济医院综合医疗科武汉430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部、卫生部器官移植重点实验室武汉430030

目的:探讨RNA干扰Caspase-3基因及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠Caspase-3基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-Caspase-3shRNA,用电穿孔法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的... 详细信息

目的:探讨RNA干扰Caspase-3基因及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠Caspase-3基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-Caspase-3shRNA,用电穿孔法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的表达Caspase-3 shRNA的细胞系。实验分为3组:①正常对照组:未转染的RK3E细胞;②阴性对照组:转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;③实验组:转染Caspase-3 shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖(LPS)孵育12小时后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR检测mRNA的表达,以及各组Caspase-8蛋白的活性。结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P<0.01),Caspase-3的mRNA水平和蛋白活性显著降低(P<0.01)。结论:针对Caspase-3的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的发生。

关键词： RNA干扰 Caspase-3 基因沉默细胞凋亡

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Caspase-3和Caspase-8肝脏缺血再灌注损伤基因沉默保护大鼠

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中华实验外科杂志 2008年第5期25卷 594-596,682页

作者：陈栋张艳朱珉郭晖刘斌陈刚张伟杰陈知水陈实陈孝平华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所卫生部/教育部器官移植重点实验室武汉430030 综合医疗科

目的观察caspase-3和caspase-8基因沉默对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（（IRI）的保护作用。方法分别构建针对大鼠caspase-3和caspase-8基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体。肝脏IRI前48h经门静脉注射磷酸盐缓冲液（PBS）、空载体或cas... 详细信息

目的观察caspase-3和caspase-8基因沉默对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（（IRI）的保护作用。方法分别构建针对大鼠caspase-3和caspase-8基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体。肝脏IRI前48h经门静脉注射磷酸盐缓冲液（PBS）、空载体或caspase-3和caspase．8shRNA。实验随机分为4组，假手术组、PBS组、空载体组和shRNA组。阻断大鼠70％人肝血流40min，再灌注6、12、24h、3、5、7d检测血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平，肝组织Caspase-3和caspase-8 mRNA的表达，caspase-3和caspase-8蛋白活性，细胞凋亡情况，丙二醛（MDA）以及超氧化物岐化酶（SOD）的含量。结果与PBS组和空载体组比较，shRNA组再灌注6、12、24h、3、5d血清ALT和AST水平显著降低（P〈0．05），caspase-3和caspase-8mRNA水平、caspase-3和caspase-8蛋白活性（caspase-3活性：0．18±0．03比0．36±0．03和0．38±0．02，P〈0．05；caspase-8活性：0．16±0．03比0．32±0．02和0．34±0．03，P〈0．05）、肝细胞凋亡指数[（22．46±3．25）％比（35．24±2．33）％和（37．36±2．51）％，P〈0．05]和肝组织中MDA含量[（76．2±15．3）比（123．5±12．4）、（136．7±13．6）nmoVmg，P〈0．05）显著降低，SOD活性显著升高[（24．1±3．2）比（12．2±3．1）、（11．4±2．9）U／mg，P〈0．05]。结论caspase．3和caspase．8基因沉默可以抑制细胞凋亡的发生，从而起到保护肝脏IRI的作用。

关键词：肝脏缺血再灌注损伤 Caspase-3 Caspase-8 基因沉默

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α1，3-半乳糖基转移酶基因沉默对NK细胞介导的异种细胞毒作用的影响

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中华器官移植杂志 2008年第8期29卷 460-463页

作者：朱珉祁洪刚曹荣华王璐黄亚冰刘斌林正斌陈知水陈刚陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所国家教育部、卫生部器官移植重点实验室武汉430030

目的探讨α1，3-半乳糖基转移酶（α1，3-GT）基因沉默对人自然杀伤（NK）细胞介导的异种细胞毒作用的影响。方法将培养的永生化猪血管内皮细胞系细胞株PED分为3组。转染组：PED转染了特异性α1，3-GT核糖核酸干扰分子（siRNA-1）；错... 详细信息

目的探讨α1，3-半乳糖基转移酶（α1，3-GT）基因沉默对人自然杀伤（NK）细胞介导的异种细胞毒作用的影响。方法将培养的永生化猪血管内皮细胞系细胞株PED分为3组。转染组：PED转染了特异性α1，3-GT核糖核酸干扰分子（siRNA-1）；错配组：PED转染了错配的SiRNA；空转染组：PED未转染SiRNA。观察各组PED与人NK细胞系细胞株NK92在静止和流动状态下的粘附作用、不同效靶比下的NK92细胞毒作用以及PED和NK92混和培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）的水平。结果PED转染后48h，转染组、错配组和空转染组在静止状态下粘附NK92的数量（个）分别为262±26、275±24和252±23；流动状态下分别为132±12、125±15和110±20，无论是静止还是流动状态下，各组PED对NK92的粘附能力的比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。无论PED是否被活化，在相同效靶比下NK92对各组PED的杀伤率的比较，差异均无统计学意义（P〉0．05），但杀伤率与效靶比呈正相关。NK92与PED共孵育早期即有反应性IFN-γ分泌，其分泌水平[（366．9±28．7）ng／L]较其自发分泌水平[（60．1±6．4）ng／L]增加了5倍，在共孵育后12h分泌值最高，但各组间不同时段IFN-γ分泌值的比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论利用RNA干扰技术下调PED上的α1，3-半乳糖残基（reGal）的表达，未引起NK92和PED相互作用的明显改变。α-Gal可能并非是NK细胞作用的靶位点，其表达量的高低对NK细胞的活化、粘附及杀伤能力未产生负性影响。

关键词： RNA干扰杀伤细胞,天然内皮细胞半乳糖转移酶类

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终末期糖尿病肾病患者移植术前的评估与处理

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中华器官移植杂志 2008年第1期29卷 47-48页

作者：明长生华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部器官移植国家重点实验室武汉430030

终末期糖尿病肾病（ESDN）患者往往伴有各种慢性并发症，如心脏病、眼病、糖尿病足和神经病变等，病情较为复杂。由于这类患者的易感性、全身血管病变和组织修复能力减弱等，使得肾移植术后的并发症增多，危险性上升，影响切口的愈合和... 详细信息

终末期糖尿病肾病（ESDN）患者往往伴有各种慢性并发症，如心脏病、眼病、糖尿病足和神经病变等，病情较为复杂。由于这类患者的易感性、全身血管病变和组织修复能力减弱等，使得肾移植术后的并发症增多，危险性上升，影响切口的愈合和受者的术后康复。因此，必要的术前检查和充分的术前准备对移植成功与否及移植物的长期存活极为重要。

关键词：终末期糖尿病肾病肾移植术后术前准备糖尿病肾病患者慢性并发症评估组织修复能力神经病变

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输注调节性T细胞延缓非肥胖糖尿病小鼠糖尿病的发生

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中华实验外科杂志 2008年第5期25卷 574-576页

作者：张伟杰吴轲陈必成徐逸林星光昌盛陈忠华郑少玲华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部、卫生部器官移植重点实验室武汉430030 温州医学院附属第一医院移植中心

目的观察过继输注调节性T细胞（Treg）对非肥胖糖尿病（NOD）小鼠自发性糖尿病发生的影响。方法分选NOD小鼠天然调节性T细胞（nTreg），并诱导Naive T细胞转化为CD4^＋CD25^＋ Foxp3^＋调节性T细胞（iTreg），分别输注予4周龄的雌性NOD... 详细信息

目的观察过继输注调节性T细胞（Treg）对非肥胖糖尿病（NOD）小鼠自发性糖尿病发生的影响。方法分选NOD小鼠天然调节性T细胞（nTreg），并诱导Naive T细胞转化为CD4^＋CD25^＋ Foxp3^＋调节性T细胞（iTreg），分别输注予4周龄的雌性NOD小鼠，观察糖尿病的发生情况，并确定细胞输注后Treg在体内的分布、检测血清中TGF-β1、IL-10及IL-4的表达以探讨Treg的作用机制。结果对照组小鼠13周龄时即100％自发性发生糖尿病，而输注iTreg和nTreg分别能延缓糖尿病的发生时间至24周龄和25周龄，与对照组比较差异有统计学意义（P〉0．05）。Treg细胞输注后主要分布在胸腺，iTreg在体内能促进TGF-β1、IL-10及IL-4表达的上调[血中浓度分别为（543．00±26．51）、（107．67±12．66）、（93．33±12．58）ng／L]，与对照组比较差异有统计学意义[（60．67±15．82）、（20．67±6．03）、（30．67±5．51）ng／L，P〈0．05]。结论在体外诱导生成的调节性T细胞可延缓NOD小鼠糖尿病的发生，其机制与上调具有免疫抑制效应的细胞因子相关。

关键词：调节性T细胞糖尿病自身免疫性

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减少或撤除环孢素A的免疫抑制方案在HBV-DNA阳性肾移植患者中的应用

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中国综合临床 2008年第11期24卷 1158-1160页

作者：陈栋张伟杰陈知水曾凡军刘斌魏来陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所卫生部/教育部器官移植重点实验室武汉430030

目的探讨减少或撤除环孢素A（CsA）的免疫抑制方案在乙型病毒性肝炎DNA阳性肾移植患者中的应用价值。方法对我院2004年1月至2007年12月64例肾移植术后HBV—DNA阳性患者初始免疫抑制剂的治疗方案进行总结，分为：①环孢素A（CsA）＋霉酚... 详细信息

目的探讨减少或撤除环孢素A（CsA）的免疫抑制方案在乙型病毒性肝炎DNA阳性肾移植患者中的应用价值。方法对我院2004年1月至2007年12月64例肾移植术后HBV—DNA阳性患者初始免疫抑制剂的治疗方案进行总结，分为：①环孢素A（CsA）＋霉酚酸酯（MMF）组（A组），CsA的谷值C0在200～250ng／ml，MMF用量在1．0—1．5g／d；②普乐可复（FK506）＋MMF组（B组），FK506的谷值浓度维持在7～9ng／ml，MMF用量在1．0～1．5g／d；③低剂量CsA＋西罗莫司（SRL）组（C组），CsA的谷值C0在150ng／ml左右，C0维持750ng／ml左右，SRL浓度维持在6—10ng／ml。所有病例应用恩替卡韦抑制HBV-DNA的复制和常规保肝利胆治疗，随访6个月。结果三组肾移植术后急性排斥反应的发生率差异无统计学意义（P〉0．05），A组有12例（80％）患者出现肝功能异常，HBV-DNA转阴者8例（53％），应用恩替卡韦抑制乙型肝炎病毒复制和加强护肝治疗后，有7例肝功能好转，其中肝功能恢复缓慢且HBV-DNA持续阳性者2例改为FK506＋MMF的治疗方案，3例改为低剂量CsA＋SRL的治疗方案。B组有5例（20％）患者出现肝功能异常，HBV-DNA转阴者18例（75％）。C组有4例（16％）患者出现肝功能异常，HBV—DNA转阴者18例（72％）。结论减少或撤除CsA的免疫抑制方案对于HBV-DNA阳性的。肾移植患者是安全有效的，不增加排斥反应的发生，也不加重肝功能的损害。

关键词：肾移植 HBV-DNA 环孢素A

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中孕期小鼠CD4^+Foxp^(3+)调节性T细胞的比例变化

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现代免疫学 2008年第6期28卷 452-456页

作者：昌盛汪理林星光金昊童荔陈忠华华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所国家教育部/卫生部重点实验室武汉430030

本实验通过检测中孕期小鼠全身及局部CD4+Foxp3+调节性T细胞的比例变化,探讨妊娠状态下CD4+Foxp3+调节性T细胞与异基因胎儿抗原刺激之间的相互关系。将成熟B ALB/c雌鼠与BALB/c雄鼠或C57BL/6雄鼠交配作为实验组,选取未孕BALB/c雌鼠为对... 详细信息

本实验通过检测中孕期小鼠全身及局部CD4+Foxp3+调节性T细胞的比例变化,探讨妊娠状态下CD4+Foxp3+调节性T细胞与异基因胎儿抗原刺激之间的相互关系。将成熟B ALB/c雌鼠与BALB/c雄鼠或C57BL/6雄鼠交配作为实验组,选取未孕BALB/c雌鼠为对照组。受孕10~12 d后分离小鼠的外周血、脾脏、淋巴结、胎盘,分别用流式细胞学、免疫组化、RT-PCR法检测相关组织中的CD4+Foxp3+调节性T细胞的变化。结果:(1)流式检测实验组中同基因孕鼠和异基因孕鼠脾脏的CD4+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的比例较对照组明显增高(P<0.01);但是同基因和异基因孕鼠之间这类细胞比例的变化并无明显差异(P>0.05)。同样,在淋巴结和外周血中也取得类似结果;(2)免疫组化S-P法显示对照组和实验组均可在脾脏、髂淋巴结组织中表达Foxp3,但是对照组Foxp3+调节性细胞的数目显著低于实验组(P<0.01),但是同基因和异基因妊娠组间无明显差异(P>0.05);(3)RT-PCR法从同基因孕鼠和异基因孕鼠的胎盘局部检出Foxp3 mR-NA的表达。中孕期小鼠全身相关组织中CD4+Foxp3+调节性T细胞的比例显著增高,其扩增并非由于父系来源的MHC抗原所致,而是由妊娠本身所介导。另外,在胎盘局部有Foxp3 mRNA的高表达,由此推测CD4+Foxp3+调节性T细胞可能在母胎界面的局部发挥作用,抑制针对胎儿的免疫排斥。

关键词：妊娠母胎耐受 CD4+Foxp3+调节性T细胞 Foxp3

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转人CD46基因抑制人补体在转基因小鼠心脏组织中的沉积

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中华器官移植杂志 2008年第11期29卷 645-648页

作者：谢林魏庆信李文鑫王树森李荣曾梦华朱珉郭晖陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部器官移植重点实验室武汉430030 湖北省农业科学院生物技术研究所武汉大学生命科学院

目的观察转人源性膜辅助蛋白（CD46）基因对转基因小鼠心脏中人补体沉积的抑制作用。方法以近交系昆明小鼠为对象，采用显微注射法制备转人CD46基因小鼠，用逆转录聚合酶链法（RT_PCR法）检测外源基因的整合情况。以F0代转基因小鼠11只... 详细信息

目的观察转人源性膜辅助蛋白（CD46）基因对转基因小鼠心脏中人补体沉积的抑制作用。方法以近交系昆明小鼠为对象，采用显微注射法制备转人CD46基因小鼠，用逆转录聚合酶链法（RT_PCR法）检测外源基因的整合情况。以F0代转基因小鼠11只为实验组，同窝非转基因小鼠10只为对照，快速切取小鼠心脏，用改良的Langendorff法经小鼠主动脉逆行灌注预先制备的含补体的B型血人血浆。观察并记录小鼠心脏搏动时间；采用免疫荧光和免疫组织化学法检测小鼠心脏组织中补体C3。及C9的沉积情况。结果Fn代转基因小鼠外源基因的整合率为33．3％。实验组小鼠心脏搏动时间为（42．6±20．6）min（15±77min），长于对照组的（20．2±12．5）min（7±40min），差异有统计学意义（P〈0．01）。实验组小鼠心脏组织中补体G3c及C9的沉积均少于对照组。结论通过显微注射法制备的转人CD46基因小鼠，其外源基因可稳定表达；转人CD46基因可以抑制人补体C3c及C9在转基因小鼠心脏组织中的沉积。

关键词：转基因移植异种补体小鼠

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rAAV-Fab转染小鼠骨骼肌体内表达分析

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免疫学杂志 2008年第5期24卷 576-578页

作者：潘桃蔡明唐莉朱彤周立桥李建斌宋世会郭晖肖啸陈知水华中科技大学同济医学院同济医院器官移植研究所教育部、卫生部重点实验室武汉430030 宁波大学医学院附属泌尿肾病医院移植科宁波315000 美国匹兹堡大学医学院矫形外科生化分子基因治疗实验室宾夕凡尼亚州匹兹堡15261 华中科技大学同济医学院同济医院传染科武汉430030

目的乙肝表面抗体是一种保护性抗体,利用基因重组法构建含乙肝表面抗原抗体Fab基因的重组腺相关病毒(rAAV-Fab),通过转染小鼠腿部骨骼肌,观察此种转染途径,Fab的表达情况。方法肌肉注射1011、5×1010、5×1093种滴度的rAAV-Fab... 详细信息

目的乙肝表面抗体是一种保护性抗体,利用基因重组法构建含乙肝表面抗原抗体Fab基因的重组腺相关病毒(rAAV-Fab),通过转染小鼠腿部骨骼肌,观察此种转染途径,Fab的表达情况。方法肌肉注射1011、5×1010、5×1093种滴度的rAAV-Fab,感染小鼠腿部肌肉组织,用荧光免疫吸附法检测血清中Fab含量变化。免疫组化分析表达分布。病理组织学检测转染后组织损伤。结果小鼠肌注rAAV-Fab后,2个月内在血清中均有持续较高表达Fab,其后呈现较低趋势,直至第4个月观察结束。转染后,全身多个脏器组织切片均可检测到阳性信号,但3种病毒滴度转染比较,肝脏转染并无差异。主要脏器病理检查结果为阴性。结论骨骼肌转染rAAV-Fab能够有效介导Fab基因在小鼠体内表达,转染广泛,且此方法安全有效,为进一步实验研究提供了依据。

关键词：腺相关病毒基因表达 Fab 肌肉

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中国胰肾联合移植现状

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肝胆胰外科杂志 2008年第3期20卷 153-155页

作者：明长生陈孝平华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部器官移植重点实验室武汉430030

由于胰腺外分泌处理和移植胰腺排斥反应难以诊断的特殊性．胰腺移植在大器官移植总数和移植效果上曾远远落后于肾、心脏和肝等器官移植。直至近10余年，随着新型强效免疫抑制剂的临床应用、器官保存技术的改进和移植手术方式的日趋成熟... 详细信息

由于胰腺外分泌处理和移植胰腺排斥反应难以诊断的特殊性．胰腺移植在大器官移植总数和移植效果上曾远远落后于肾、心脏和肝等器官移植。直至近10余年，随着新型强效免疫抑制剂的临床应用、器官保存技术的改进和移植手术方式的日趋成熟，胰腺移植受者和移植胰腺的存活率均显著提高。胰、肾联合移植已成为治疗l型糖尿病、部分2型糖尿病合并尿毒症的有效方法。

关键词：胰腺移植肾移植适应证糖尿病肾病

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