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中华器官移植杂志 2010年第3期31卷 173-176页

作者：黄伟陈知水张伟杰程敦秀汪芯王大卫周平华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所卫生部/教育部器官移植重点实验室武汉430030

目的比较流式细胞术检测群体反应性抗体（FLOW-PRA）的方法与传统的酶联免疫吸附检测群体反应性抗体（ElISAPRA）的方法在临床器官移植巾应朋的相关性、灵敏性、准确性及实用性。方法采用FLOW-PRA和ELISAPRA两种方法对212份等待肾移植... 详细信息

目的比较流式细胞术检测群体反应性抗体（FLOW-PRA）的方法与传统的酶联免疫吸附检测群体反应性抗体（ElISAPRA）的方法在临床器官移植巾应朋的相关性、灵敏性、准确性及实用性。方法采用FLOW-PRA和ELISAPRA两种方法对212份等待肾移植患者的血清进行检测，对两种方法的检出结果进行比较分析。结果FLOW-PRA和ELISAPRA两种方法各耗时1．5h和3h。两种方法所得结果有很好的相关性，PRAⅠ类和PRAⅡ类检测结果的相关系数分别为0．94和0．89。采用FLOWPRA法检出PRAI类和Ⅱ类阳性率分别为24．5％和18．4％，采用ELISA-PRA法检出PRAI类和Ⅱ类的阳性率分别为17．9％和14．6％，FLOW-PRA法的阳性检出率明显高于ELISA—PRA法。FLOW-PRA法能准确检测到低浓度抗体及其抗体特异性。结论与ELISA-PRA法相比，FLOW-PRA法简单快捷，有更高的敏感性和准确性，对低致敏患者有更高的阳性检出率，更适合临床器官移植对PRA的检测。

关键词：流式细胞术酶联免疫吸附测定群体反应性抗体

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致敏患者肾移植的处理策略

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中华器官移植杂志 2010年第6期31卷 325-327页

作者：张伟杰华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部器官移植重点实验室武汉430030

随着肾移植例数的增长,近年来国内外各大移植中心的移植物功能丧失及致敏受者也迅速增多.2007年美国器官获取及移植网络（OPTN）和器官移植受体科学登记处（SRTR）的年报显示,在等待肾移植的患者中高致敏患者（群体反应性抗体≥80%）占1... 详细信息

随着肾移植例数的增长,近年来国内外各大移植中心的移植物功能丧失及致敏受者也迅速增多.2007年美国器官获取及移植网络（OPTN）和器官移植受体科学登记处（SRTR）的年报显示,在等待肾移植的患者中高致敏患者（群体反应性抗体≥80%）占15.8%.体内预存的高水平的抗HLA抗体不仅可诱发各种类型的排斥反应、延缓移植物功能恢复,而且还与移植物功能丧失相关.目前,对致敏受者的临床处理尚缺乏公认的理想措施,本文就有关问题进行探讨,以期为致敏受者的肾移植提供借鉴.

关键词：致敏患者肾移植群体反应性抗体致敏受者抗HLA抗体器官获取功能丧失移植物

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小鼠galectin-9可通过分泌形式诱导Tim-3^-T细胞凋亡

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第2期30卷 144-149页

作者：何文涛袁劲徐逸周鸿敏蔡兰军郭晖李超左利群宫念樵陈忠华华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部重点实验室武汉430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院肾内科

目的构建小鼠galectin-9重组腺病毒pAd-gal-9,探讨galectin-9的真核表达定位以及galectin-9诱导T细胞凋亡与Tim-3表达的关系.方法常规分子克隆方法结合LR反应构建腺病毒重组质粒pAd/CMV/V5-DEST-gal-9,以Pac I线性化后,用脂质体2000... 详细信息

目的构建小鼠galectin-9重组腺病毒pAd-gal-9,探讨galectin-9的真核表达定位以及galectin-9诱导T细胞凋亡与Tim-3表达的关系.方法常规分子克隆方法结合LR反应构建腺病毒重组质粒pAd/CMV/V5-DEST-gal-9,以Pac I线性化后,用脂质体2000体外转染293A细胞,8 d后反复冻融细胞3次收集含病毒上清,并以此上清感染293A细胞大量扩增病毒***密度梯度离心法纯化病毒,96孔板法梯度感染293A细胞测定病毒滴度,然后感染CHO细胞,用免疫组化、Western blot和流式细胞仪分析galectin-9的表达水平和定位;以新鲜培养的上清或固相化的细胞分别与外周淋巴结细胞进行培养,AnnexinV/PI法检测T细胞凋亡情况,对比凋亡细胞比例与Tim-3^＋ T细胞的比例.结果重组腺病毒构建及表达成功,免疫组化表明galectin-9在CHO胞质表达;Westernblot证实galectin-9表达;流式分析表明胞内染色组galectin-9平均荧光强度显著高于表面染色组,病毒感染CHO表面染色组与空白对照组galectin-9平均荧光强度无明显区别;新鲜培养的上清可以明显诱导T细胞发生凋亡,显著高于Tim-3^＋ T细胞的比例.结论重组腺病毒pAd-gal-9构建成功,体外感染pad-gal-9的CHO分泌galectin-9诱导T细胞凋亡可以不依赖Tim-3的表达.

关键词：半乳糖凝集素-9 胞内染色凋亡 T细胞

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Tim-3在小鼠心脏移植受者体内不同部位T淋巴细胞上表达的变化

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中华器官移植杂志 2010年第3期31卷 141-143页

作者：方泽民何文涛王升蔡兰军雒真龙张维娜周鸿敏陈忠华明长生华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部器官移植重点实验室武汉430030

目的检测激活的TH1类淋巴细胞标记分子“T淋巴细胞免疫球蛋白域及粘蛋白域蛋白-3（Tim-3）”在受者体内不同部位T淋巴细胞上表达的变化，探讨其与急性排斥反应的关系。方法建立小鼠同基因和异基因心脏移植模型（简称：同基因组和异基... 详细信息

目的检测激活的TH1类淋巴细胞标记分子“T淋巴细胞免疫球蛋白域及粘蛋白域蛋白-3（Tim-3）”在受者体内不同部位T淋巴细胞上表达的变化，探讨其与急性排斥反应的关系。方法建立小鼠同基因和异基因心脏移植模型（简称：同基因组和异基因组）；移植术后第3和第6天，分离和制备两组受者外周血、脾脏、引流淋巴结和移植心内淋巴细胞悬液，采用流式细胞仪检测Tim-3阳性细胞在CD4＋和CD8＋T淋巴细胞中的比值。结果两组受者术后外周血和脾脏内Tim-3＋／CD4＋以及Tim-3＋／CD8＋的比值比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。与同基因组比较，异基因组引流淋巴结内Tim-3＋／CD4＋比值轻度升高（P〈0．05）；但异基因组术后第6天与第3天比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。与同基因组比较，移植心内Tim-3＋／CD4＋和Tim-3＋／CD8＋比值均显著升高（P〈0．01）；异基因组术后第6天与第3天比较，移植心内Tim-3＋／CD4＋和Tim-3＋／CD8＋比值也显著升高（P＜0．01）。结论小鼠异基因心脏移植受者引流淋巴结和移植心内T淋巴细胞上Tim-3的表达升高与急性排斥反应的进展动态相关。

关键词： Tim-3 心脏移植移植物排斥 T淋巴细胞

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TH17型细胞的分化及调节在自身免疫性疾病和排斥反应中的作用

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中华器官移植杂志 2010年第1期31卷 60-62页

作者：雷钧陈知水华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所卫生部/教育部器官移植重点实验室武汉430030

初始T淋巴细胞被树突状细胞活化后，在体内不同的微环境下可分化成为功能及表型不同的效应性T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞（Treg细胞）。当有白细胞介素12（IL-12）存在时，初始T淋巴细胞分化为TH1型细胞，主要分泌IL-12、γ干扰素（IFN... 详细信息

初始T淋巴细胞被树突状细胞活化后，在体内不同的微环境下可分化成为功能及表型不同的效应性T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞（Treg细胞）。当有白细胞介素12（IL-12）存在时，初始T淋巴细胞分化为TH1型细胞，主要分泌IL-12、γ干扰素（IFN-γ）及特异性表达转录因子T-bet；有IL-4存在时，初始T淋巴细胞分化为TH2型细胞，主要分泌IL-4、IL-10，特异性表达转录因子GATA-3；在转化生长因子β（TGF-β）单独存在时，初始T淋巴细胞分化为Treg细胞，

关键词：淋巴细胞分化树突状细胞活化自身免疫性疾病调节性排斥反应 Treg细胞 T淋巴细胞转化生长因子β

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短发夹状RNA基因沉默补体受体C5aR及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡

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中国免疫学杂志 2010年第2期26卷 151-154页

作者：陈栋张艳李明尹注增陈刚张伟杰陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部器官移植重点实验室武汉430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院综合医疗科武汉430030

目的:探讨短发夹状RNA基因沉默补体受体C5aR及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠补体受体C5aR基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-C5aR shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418... 详细信息

目的:探讨短发夹状RNA基因沉默补体受体C5aR及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠补体受体C5aR基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-C5aR shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的表达C5aR shRNA的细胞系。实验分为3组,①正常对照组:未转染的RK3E细胞;②阴性对照组:转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;③实验组:转染C5aR shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖(LPS)孵育12小时后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR检测mRNA的表达,γ计数仪测定125I标记的C5a与RK3E的结合情况。结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P<0.01),C5aR mRNA水平显著降低(P<0.01),125I标记的C5a与RK3E结合活性显著下降。结论:针对C5aR的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的发生。

关键词： RNA干扰 C5aR 基因沉默凋亡

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改良法分离小鼠移植心内浸润淋巴细胞

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中华实验外科杂志 2010年第9期27卷 1222-1223页

作者：方泽民何文涛王升周鸿敏陈忠华明长生华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部重点实验室武汉430030

目的建立简便而高效的分离小鼠心脏移植物内浸润淋巴细胞的方法.方法移植物剪碎后用Ⅱ型胶原酶（250 U/ml,30～40 min）消化,Ficoll密度梯度离心（800 g/min,20 min）分离单个核细胞,荧光标记抗体行表面抗原或胞内细胞因子染色后用流... 详细信息

目的建立简便而高效的分离小鼠心脏移植物内浸润淋巴细胞的方法.方法移植物剪碎后用Ⅱ型胶原酶（250 U/ml,30～40 min）消化,Ficoll密度梯度离心（800 g/min,20 min）分离单个核细胞,荧光标记抗体行表面抗原或胞内细胞因子染色后用流式细胞仪分析其亚群.结果移植物分离的单个核细胞数量稳定在1 × 10^6个以上,淋巴细胞的比例为（31.9±2.3）%,活性（95.1±2.1）%,流式细胞仪能同时检测到荧光标记的淋巴细胞表面和胞内的抗原.结论本法单用胶原酶消化移植心,减少了对心脏移植物内浸润淋巴细胞的损伤,获得的细胞可进一步用于流式表型分析.

关键词：心脏移植淋巴细胞移植物胶原酶Ⅱ 流式细胞仪

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CD3/Crry共刺激通路对小鼠CD4^+ T细胞的免疫调控

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实用医学杂志 2010年第2期26卷 190-192页

作者：陈栋李明尹注增刘斌陈刚张伟杰陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所卫生部/教育部器官移植重点实验室武汉市430030

目的:探讨CD3/Crry共刺激通路对小鼠CD4+T细胞的免疫调控及其机制。方法:分离C57BL/6小鼠的脾脏CD4+T细胞,体外检测CD3、CD28、Crry、CD3/CD28、CD3/Crry、CD3/CD28/Crry共刺激对CD4+T细胞增殖的作用效果,并检测其细胞上清液中白细胞介... 详细信息

目的:探讨CD3/Crry共刺激通路对小鼠CD4+T细胞的免疫调控及其机制。方法:分离C57BL/6小鼠的脾脏CD4+T细胞,体外检测CD3、CD28、Crry、CD3/CD28、CD3/Crry、CD3/CD28/Crry共刺激对CD4+T细胞增殖的作用效果,并检测其细胞上清液中白细胞介素-2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-10(IL-10)的水平。结果:与CD3组相比,CD3/CD28、CD3/Crry和CD3/CD28/Crry共刺激后,CD4+T细胞均出现显著增殖反应(P<0.05),而且CD3/CD28/Crry共刺激组的增殖活性较CD3/CD28或CD3/Crry共刺激组显著增高(P<0.05)。CD3/CD28共刺激后,IL-2和IFN-γ水平较CD3、CD28、Crry组和CD3/Crry组显著升高(P<0.05),CD3/Crry共刺激后,IL-4水平较CD3、CD28、Crry组和CD3/CD28共刺激组显著升高(P<0.05),各组IL-10水平无显著差异(P>0.05)。结论:CD3/Crry共刺激通路诱导CD4+T细胞产生分泌IL-4,抑制IL-2和IFN-γ的产生,有可能诱导同种移植免疫低反应性。

关键词： T淋巴细胞 CD3/Crry 共刺激通路 CD4+T细胞

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RNA干扰Kupffer细胞肿瘤坏死因子-α减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤

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中华肝胆外科杂志 2010年第10期16卷 767-769页

作者：陈栋张艳郭晖刘斌陈刚张伟杰陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所卫生部/教育部器官移植重点实验室武汉430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院综合医疗科

目的观察RNA干扰肝脏Kupffer细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用.方法构建针对大鼠TNF-α基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体.肝脏缺血再灌注损伤前48 h经门静脉注射磷酸盐缓冲液（PBS）、空载体... 详细信息

目的观察RNA干扰肝脏Kupffer细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用.方法构建针对大鼠TNF-α基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体.肝脏缺血再灌注损伤前48 h经门静脉注射磷酸盐缓冲液（PBS）、空载体或TNF-α shRNA.实验随机分为4组,假手术组、PBS组、空载体组和shRNA组.阻断大鼠70%入肝血流40 min,再灌注6 h检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肝脏Kupffer细胞TNF-α mRNA、血清TNF-α、肝组织中丙二醛（MDA）以及超氧化物岐化酶（SOD）含量.结果与PBS组和空载体组比较,shRNA组再灌注6 h后血清ALT和AST水平显著降低（P＜0.05）,Kupffer细胞TNF-α mRNA水平、血清TNF-α水平（56.6±6.7 pg/ml比87.8±8.7 pg/ml和96.5±7.3 pg/ml,P＜0.05）、肝组织中MDA含量（93.4±13.3 nmol/mg比133.5±12.4 nmo1/mg和136.7±13.6 nmol/mg,P＜0.05）显著降低,SOD活性显著升高（22.4±4.6 U/mg比12.2±3.1 U/mg和11.4±2.9 U/mg,P＜0.05）.结论 RNA干扰Kupffer细胞TNF-α基因的表达可以减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤.

关键词：再灌注损伤肝脏肿瘤坏死因子 Kupffer细胞 RNA干扰

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体外分化的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞可减轻小鼠皮肤移植急性排斥反应

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华中科技大学学报（医学版） 2010年第6期39卷 733-737页

作者：袁劲吴轲陈忠华华中科技大学同济医学院附属同济医院肾内科武汉430030 华中科技大学同济医学院附属协和医院胃肠外科武汉430022 华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所器官移植教育部/卫生部重点实验室(华中科技大学)武汉430030

目的利用转化生长因子-β1(TGF-β1)体外诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞,通过体内输注延长小鼠皮肤移植物存活时间,并研究其相关机制。方法分选获取CD4+CD25-T细胞,根据诱导条件不同分为3组:对照组、无TGF-β1刺激组和T... 详细信息

目的利用转化生长因子-β1(TGF-β1)体外诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞,通过体内输注延长小鼠皮肤移植物存活时间,并研究其相关机制。方法分选获取CD4+CD25-T细胞,根据诱导条件不同分为3组:对照组、无TGF-β1刺激组和TGF-β1组。检测CD4+CD25+T细胞比例,并用RT-PCR检测Foxp3 mRNA的表达水平。建立小鼠皮肤移植模型,于0、1、2、3 d输注上述细胞,观察皮肤移植物存活时间,并检测移植物的病理改变和受鼠外周淋巴细胞的增殖能力。结果 TGF-β1组中CD4+CD25+T细胞比例与无TGF-β1刺激组相近,但高表达Foxp3 mRNA(P<0.05)。将培养的细胞输注给受鼠后发现,输注无TGF-β1刺激组细胞的受鼠其移植物平均存活时间(mean survival time,MST)为(7.3±1.6)d,低于对照组(P<0.05);而输注TGF-β1组细胞小鼠MST为(24.1±2.5)d,较对照组和无TGF-β1刺激组明显延长(P<0.05)。病理检测亦显示TGF-β1组受鼠移植物结构完整,无明显淋巴细胞浸润。用Alamar Blue法检测受鼠外周淋巴细胞增殖活性显示,TGF-β1组受鼠淋巴细胞增殖能力被明显抑制,低于对照组。进一步检测外周血中IL-4和IFN-γ的表达水平,结果显示TGF-β1组小鼠体内IL-4和IFN-γ均明显低于对照组和无TGF-β1刺激组。结论 TGF-β1可诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞,将诱导后的调节性T细胞进行过继输注可延长小鼠皮肤移植物存活时间。

关键词：转化生长因子-β1 调节性T细胞皮肤移植

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