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表达副猪格拉瑟菌GAPDH和OmP26的重组猪霍乱沙门氏菌构建及免疫学评价

华南农业大学学报 2025年第03期46卷 319-325页

作者：陈丽璇符颖陈政权李莉莉张伟孝张建民人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业农村部人兽共患病重点实验室/农业农村部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病重点实验室/华南农业大学兽医学院

【目的】构建能同时表达副猪格拉瑟菌Glaesserella parasuis关键抗原GAPDH和OmP26的重组猪霍乱沙门氏菌Salmonella choleraesuis，并评估其作为二联疫苗候选株的潜力，以期为预防G. parasuis和***感染提供一种新型高效的解决方法。【方... 详细信息

【目的】构建能同时表达副猪格拉瑟菌Glaesserella parasuis关键抗原GAPDH和OmP26的重组猪霍乱沙门氏菌Salmonella choleraesuis，并评估其作为二联疫苗候选株的潜力，以期为预防G. parasuis和***感染提供一种新型高效的解决方法。【方法】选取多种血清型的G. parasuis中广泛存在的抗原GAPDH和OmP26作为外源抗原，以S. choleraesuis C500Δasd缺失株为载体，构建同时表达GAPDH和OmP26的G. parasuis-S. choleraesuis重组菌株，并对其生物学特性和免疫效果展开研究。【结果】PCR与测序结果共同表明，本研究成功构建重组菌株C501(pYA-GAPDH-OmP26)，该菌株能稳定携带GAPDH和OmP26基因片段(大小分别为1 020和798 bp)，在连续传代100次中均能稳定扩增目标片段；且生长曲线、生化特性与对照菌C501(pYA3493)一致。重组菌株C501(pYA-GAPDH-OmP26)对S. choleraesuis C78-1和G. parasuis 5型强毒株SH0165的保护率分别为62.5%和50.0%，而C501(pYA3493)对S. choleraesuis C78-1的保护率为50.0%，对G. parasuis 5型强毒株SH0165则无保护作用。【结论】重组沙门氏菌C501(pYA-GAPDH-OmP26)能稳定携带异源基因，具有与亲本菌株相近的生物学特性及良好的表达特性，能够诱导机体对G. parasuis和S. choleraesuis产生联合免疫反应，为G. parasuis-S. choleraesuis二联基因工程疫苗的研发奠定了基础。

关键词：猪副猪格拉瑟菌猪霍乱沙门氏菌 C500Δasd缺失株 GAPDH OmP26

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G57基因型H9N2亚型禽流感病毒反向遗传系统的建立与验证

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畜牧兽医学报 2025年第4期56卷 1825-1833页

作者：史玉婷韩心雨钟沐卉林耀忠柳腾飞李焰尹会方贾伟新华南农业大学兽医学院国家禽流感专业实验室(广州)人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业农村部人畜共患病重点实验室农业农村部兽用疫苗创制重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东省人兽共患病防控制剂工程实验室广州510640 龙岩学院生命科学学院龙岩364012

旨在构建当前流行毒株H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)的反向遗传操作平台。毒株A/Chicken/Guangdong/M/2021(H9N2)(简称为M)分离自广东某养鸡场病料。鉴定并分析其全基因组序列,通过RT-PCR以及无缝克隆技术完成质粒构... 详细信息

旨在构建当前流行毒株H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)的反向遗传操作平台。毒株A/Chicken/Guangdong/M/2021(H9N2)(简称为M)分离自广东某养鸡场病料。鉴定并分析其全基因组序列,通过RT-PCR以及无缝克隆技术完成质粒构建,共转染293T细胞成功拯救毒株命名为rM。测定病毒的稳定性和生长曲线;进行动物试验,从传播效率、致病性角度验证克隆毒株与原毒的一致性。结果显示:M毒株为G57基因型,为近年的流行毒株。M毒株与rM毒株在酸稳定性、热稳定性、致病性以及传播性等方面保持一致的生物学特性。综上,成功建立了G57基因型H9N2亚型AIV的反向遗传系统,且从体内和体外试验两个方面全面验证M与rM的生物学特性保持一致。

关键词：反向遗传 H9N2 禽流感病毒 G57基因型

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F亚群禽白血病病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

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广东畜牧兽医科技 2025年第2期50卷 23-29页

作者：潘洪艳李锦群李琪袁伊琳曹伟胜华南农业大学兽医学院广东广州510642 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业农村部兽用疫苗创制重点实验室/农业农村部人兽共患病重点实验室广东广州510642

为精准检测F亚群禽白血病病毒(ALV⁃F),该研究针对ALV⁃F流行毒株env基因设计了一对特异性引物F1/F2,建立了ALV⁃F的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。条件优化试验结果显示,该方法最适退火温度为64.5℃,最适引物浓度为0.4μM。利用最适... 详细信息

为精准检测F亚群禽白血病病毒(ALV⁃F),该研究针对ALV⁃F流行毒株env基因设计了一对特异性引物F1/F2,建立了ALV⁃F的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。条件优化试验结果显示,该方法最适退火温度为64.5℃,最适引物浓度为0.4μM。利用最适反应条件建立的标准曲线方程为y=-3.303x+42.525,R2=0.997,扩增效率E=100.8%,重组质粒标准品拷贝数与Ct值具有良好的线性关系。特异性试验结果表明,该方法仅能特异性检测ALV⁃F,对ALV⁃A、ALV⁃B、ALV⁃J、ALV⁃K、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)、网状内皮组织增生病病毒(REV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)无交叉反应;敏感试验结果表明,该方法最低检测限度为4.67×10^(2)拷贝/μL,敏感性是普通PCR的1000倍;稳定性试验结果表明,批间和批内稳定性试验的变异系数均小于2%。利用该方法、ALV p27 ELISA和普通PCR方法分别对23份七彩山鸡胚所制备的原代细胞(PEF)样品进行检测,结果显示该方法和普通PCR方法阳性检出率均为95.65%(22/23),而ALV p27 ELISA阳性检出率仅为39.13%(9/23),该方法与普通PCR总符合率为100%,与ALV p27 ELISA总符合率为43.48%;进一步利用该方法、病毒分离法(结合ALV p27 ELISA)和普通PCR方法分别对20份七彩山鸡抗凝血样品进行检测,结果显示该方法和普通PCR方法阳性检出率分别为100.00%(20/20)和75.00%(15/20),两者总符合率为75.00%,而病毒分离法阳性检出率为0.00%(0/20)。本研究建立的方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,能够有效检测临床样品,可以为ALV⁃F的精准检测提供技术支持。

关键词：禽白血病 ALV⁃F SYBR GreenⅠ荧光定量PCR

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2024年我国禽流感等禽病流行情况与2025年预测分析

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养禽与禽病防治 2025年第2期 2-5页

作者：贾伟新曹伟胜孙敏华刘文俊信爱国李珂叶贺佳王友令于可响瞿孝云亓文宝任涛廖明华南农业大学兽医学院国家禽流感专业实验室(广州)人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业农村部人畜共患病重点实验室农业农村部兽用疫苗创制重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东省人兽共患病防控制剂工程实验室广州510640 广东省农业科学院动物卫生研究所农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室广州510640 仲恺农业工程学院动物科技学院广州510550 云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所昆明650224 广州市华南农大生物药品有限公司广州511399 广州达农生物科技有限公司广州510145 山东省农业科学院家禽研究所济南250023

2024年我国家禽生产整体上保持良好态势,市场行情有喜有忧。禽流感防控形势严峻,威胁我国养禽业并在局部地区造成损失。本文将对我国2024年禽流感等重要家禽疫病发生情况进行简要回顾,对2025年禽病的流行趋势进行预测分析。

关键词：禽流感防控家禽生产养禽业禽病家禽疫病市场行情预测分析流行趋势

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表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白的重组假型杆状病毒对SPF鸡的免疫原性分析

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畜牧兽医学报 2013年第2期44卷 256-261页

作者：樊惠英罗琼陈筱薇叶昱辛朝安廖明华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室广州510642

本研究旨在对本实验室所构建的表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白的重组假型杆状病毒(Ac-V-S1)的免疫保护效果进行探讨。以2×109 pfu剂量的重组假型杆状病毒(Ac-V-S1)腿部肌肉注射7日龄SPF雏鸡,21日龄加强免疫1次。血清抗体检... 详细信息

本研究旨在对本实验室所构建的表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白的重组假型杆状病毒(Ac-V-S1)的免疫保护效果进行探讨。以2×109 pfu剂量的重组假型杆状病毒(Ac-V-S1)腿部肌肉注射7日龄SPF雏鸡,21日龄加强免疫1次。血清抗体检测表明,灭活疫苗组诱导的IBV特异性ELISA抗体水平最高,极显著高于其它试验组(P<0.01),其次是Prime-boost组(先免疫Ac-V-S1后免疫poly156S1亚单位疫苗)和Ac-V-S1组;但在细胞免疫水平方面,Ac-V-S1免疫组表现出较强的优势,免疫应答反应极显著的高于其它免疫组(P<0.01),然后是Prime-boost组和杆状病毒野毒对照组。二免后2周用IBV M41强毒进行攻毒保护试验。结果表明,Ac-V-S1、Ac-V-EGFP、poly156S1亚单位疫苗组的保护率分别为55%(6/11)、27%(3/11)、37%(4/11),而采用Prime-boost免疫组的保护率为64%(7/11),略低于免疫保护率为73%的常规灭活疫苗(8/11)。结果显示:重组杆状病毒Ac-V-S1具有较好的免疫效果,而且在细胞免疫方面具有较强优势,可以弥补重组杆状病毒在体液免疫水平的不足,而Prime-boost免疫策略能更进一步提高重组杆状病毒免疫效果,为将重组杆状病毒发展为经济有效的IBV基因工程疫苗奠定基础。

关键词：传染性支气管炎病毒重组杆状病毒 S1基因免疫保护

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不同样品对黄羽种鸡禽白血病病毒净化检测效果的影响

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华南农业大学学报 2015年第6期36卷 29-34页

作者：郝建勇秦建如邱倩倩袁丽霞饶明章廖明曹伟胜华南农业大学兽医学院/农业部兽用疫苗创制重点实验室广东广州510642

【目的】评估黄羽种鸡禽白血病的净化工作,比较源于同一鸡群不同样品对禽白血病病毒（ALV）检测结果的影响.【方法】采用ALV抗原ELISA方法对广东一黄羽种鸡场采集的2 691枚种蛋进行检测,根据检测结果采集其中70份不同S/P区间所对应的母... 详细信息

【目的】评估黄羽种鸡禽白血病的净化工作,比较源于同一鸡群不同样品对禽白血病病毒（ALV）检测结果的影响.【方法】采用ALV抗原ELISA方法对广东一黄羽种鸡场采集的2 691枚种蛋进行检测,根据检测结果采集其中70份不同S/P区间所对应的母鸡抗凝血,分离血浆后分别同时接种于CEF和DF-1细胞,用病毒分离方法进行检测,并用PCR方法进行亚群鉴定.【结果和结论】从送检种蛋蛋清共检出ALV p27阳性样品243份,阳性率为9.03%（243/2 691）;蛋清不同ELISA S/P区间所对应的病毒分离情况分别为：蛋清ELISA S/P≥2.0的鸡只其血样CEF和DF-1细胞病毒分离率均为100%;1.5≤S/P〈2.0的鸡只病毒分离率均为88.9%;1.0≤S/P〈1.5的鸡只病毒分离率均为85.7%;0.2≤S/P〈1.0的鸡只病毒分离率分别为60%-75%（CEF）和40%-50%（DF-1）;0.1≤S/P〈0.2的鸡只病毒分离率为62.5%（CEF）和50%（DF-1）;S/P〈0.1的鸡只分别为27.2%（CEF）和9.1%（DF-1）的病毒分离率.PCR结果显示,所有7份CEF＋DF-1-的CEF培养物中有6份为内源性ALV-E.研究表明,在蛋清ELISA检测时,S/P越高的阳性蛋清样品其对应母鸡越可能是外源性ALV病毒血症阳性;有一定比例S/P较低的阳性蛋清样品是由对应母鸡体内的内源性ALV排毒所致;而净化初期少数蛋清S/P为阴性的蛋清,其对应母鸡仍可能检出外源性ALV,说明在黄羽种鸡外源性ALV净化方案中单独使用1次蛋清ELISA检测可能会给禽白血病的净化检测造成一定的“误诊”和“漏检”.

关键词：黄羽种鸡禽白血病病毒病毒检测净化

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种禽场A亚群禽白血病病原学调查及分离株遗传进化分析

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华南农业大学学报 2014年第4期35卷 11-15页

作者：冯敏谭利强代曼曼郝建勇秦建如黄小容廖明曹伟胜华南农业大学兽医学院/农业部兽用疫苗创制重点实验室广东广州510642

【目的】了解广东地区种禽场A亚群禽白血病病毒(ALV-A)流行情况.【方法】从A、B、C、D 4个种禽场采集1 561份血浆样品,接种DF-1细胞,培养7 d后通过ELISA方法对细胞上清液进行p27抗原检测,通过PCR、间接免疫荧光试验2种方法对p27抗原阳... 详细信息

【目的】了解广东地区种禽场A亚群禽白血病病毒(ALV-A)流行情况.【方法】从A、B、C、D 4个种禽场采集1 561份血浆样品,接种DF-1细胞,培养7 d后通过ELISA方法对细胞上清液进行p27抗原检测,通过PCR、间接免疫荧光试验2种方法对p27抗原阳性样品进行鉴定.【结果和结论】从4个种禽场共检出71份阳性样品,外源性禽白血病病毒分离阳性率为4.6%.其中,仅从C种禽场分离到2株ALV-A,命名为GD13-1和GD13-2,前病毒全基因序列分别为7 721和7 715 bp,且GD13-2与J亚群禽白血病病毒混合感染.与国内外其他ALV-A的LTR、gp85核苷酸序列进行分析比对,发现该研究分离的2株ALV-A与国内A亚群分离株SDAU09E2相似度最高,其中与LTR相似性分别为96.9%、97.2%,与gp85相似性分别为98.4%、98.7%;与广东地区5年前ALV-A分离株GD08的LTR核苷酸序列相似性分别为88.9%、89.5%,与gp85相似性分别为98.5%、98.8%.调查结果表明,广东地区部分种禽场内仍然存在ALV-A感染,但ALV-A已经不是流行毒株,且变异程度不大.

关键词：种禽场 A亚群禽白血病病毒前病毒全基因组序列

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猪流行性腹泻病毒GD-A株的分离鉴定及S基因序列分析

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华南农业大学学报 2015年第4期36卷 21-25页

作者：朱俊高又文张杰叶昱廖明樊惠英华南农业大学兽医学院/农业部兽用疫苗创制重点实验室广东广州510642

【目的】在广东省某疑似发生猪流行性腹泻的猪场中,采集病猪的粪便样品,经RT-PCR检测阳性的样品接种于Vero细胞,以分离猪流行性腹泻病毒.【方法】通过在细胞上的连续传代,直至能稳定增殖.并通过RT-PCR对细胞培养物进行特异性片段的检测... 详细信息

【目的】在广东省某疑似发生猪流行性腹泻的猪场中,采集病猪的粪便样品,经RT-PCR检测阳性的样品接种于Vero细胞,以分离猪流行性腹泻病毒.【方法】通过在细胞上的连续传代,直至能稳定增殖.并通过RT-PCR对细胞培养物进行特异性片段的检测,观察细胞病变(CPE)的发生情况,以及间接免疫荧光(IFA)检测猪流行性腹泻病毒的M蛋白,对病毒进行分离与鉴定.【结果和结论】病毒在盲传5代时能观察到典型病变,传至20代时能在Vero细胞上增殖稳定.RT-PCR、CPE与IFA的结果证明,所分离到的病毒为PEDV,并命名为GD-A株.

关键词：猪流行性腹泻病毒分离鉴定 M蛋白 S基因间接免疫荧光细胞传代培养

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介导分泌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建

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华南农业大学学报 2013年第4期34卷 564-568页

作者：张春雷靳立明叶昱张杰朱俊高又文廖明樊惠英华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室广东广州510642

应用杆状病毒表达系统,将猪圆环病毒2型ORF2基因插入供体质粒pFastBacTMDual pH启动子控制下的多克隆位点,引入EGT信号肽取代ORF2原有核定位信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以便于后期的纯化.将构建质粒转... 详细信息

应用杆状病毒表达系统,将猪圆环病毒2型ORF2基因插入供体质粒pFastBacTMDual pH启动子控制下的多克隆位点,引入EGT信号肽取代ORF2原有核定位信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以便于后期的纯化.将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体,提取重组Bacmid质粒.将阳性重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞,72 h收集培养上清液获得重组杆状病毒.间接免疫荧光试验和Westernblot表明,该重组杆状病毒可以在昆虫细胞实现猪圆环病毒2型Cap蛋白的分泌表达.

关键词：猪圆环病毒2型 ORF2基因 EGT信号肽 Cap蛋白重组杆状病毒

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反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达

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中国畜牧兽医 2015年第10期42卷 2538-2543页

作者：秦建如黎娜铭许长剑廖明曹伟胜华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室广州510642

为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV)... 详细信息

为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV)p27抗原的ELISA检测盲传至第4代的细胞上清,ELISA阳性结果说明重组病毒拯救成功;荧光显微镜观察发现80%以上DF-1细胞都有明显的绿色荧光信号,证明DF-1细胞表达绿色荧光蛋白;对DF-1细胞基因组进行特异性PCR检测,扩增出特异性条带说明重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP携带的EGFP基因整合到DF-1细胞的基因组中。本研究建立的RCASBP介导反转录病毒表达体系为研究ALV基因的结构和功能奠定了基础。

关键词：禽白血病病毒反转录病毒载体RCASBP 增强型绿色荧光蛋白基因 DF-1细胞

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