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鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

中国兽医科学 2021年第1期51卷 17-23页

作者：黎金荣陈武翟俊琼关蕴李婉萍焦培荣单芬广州动物园广州市野生动物研究中心广东广州510070 华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业部兽用疫苗创制重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东广州510642

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PC... 详细信息

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10^2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10^4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。

关键词：鹦鹉博尔纳病毒荧光定量PCR 快速检测

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在ALV-K gp85交叉干扰下ALV-A gp85突变位点的研究

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中国预防兽医学报 2022年第12期44卷 1252-1260页

作者：李锦群梁灿新郑小雪陈建郭妍妍李文静陈湘曹伟胜华南农业大学兽医学院广东广州510642 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东广州510642 人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室广东广州510642 农业农村部兽用疫苗创制重点实验室广东广州510642 农业农村部人兽共患病重点实验室广东广州510642

禽白血病病毒(ALV)囊膜表面蛋白gp85与细胞受体的结合介导病毒侵入细胞。A亚群ALV(ALV-A)与K亚群ALV(ALV-K)共用细胞中的Tva受体,在ALV-K gp85交叉干扰下,ALV-A gp85与Tva结合的关键氨基酸位点可能发生突变以重新建立有效感染。为鉴定... 详细信息

禽白血病病毒(ALV)囊膜表面蛋白gp85与细胞受体的结合介导病毒侵入细胞。A亚群ALV(ALV-A)与K亚群ALV(ALV-K)共用细胞中的Tva受体,在ALV-K gp85交叉干扰下,ALV-A gp85与Tva结合的关键氨基酸位点可能发生突变以重新建立有效感染。为鉴定这些位点,本研究以前期构建的pCAGGS-s-K-gp85-flag为模板,经PCR扩增融合信号肽s和标签flag的ALV-K gp85基因并克隆至pLV-sfGFP(2A)Pure慢病毒载体,构建重组慢病毒质粒pLV-s-K-gp85-flag-GFP,并经酶切和测序鉴定后与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装获得重组慢病毒。将重组慢病毒感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素筛选获得细胞系DF-1/K-gp85。RT-qPCR和western blot检测结果显示,DF-1/K-gp85能够稳定表达ALV-K gp85基因并将62 ku左右的ALV-K gp85蛋白分泌至细胞上清;荧光和ALV p27抗原ELISA检测结果显示,过表达ALV-K gp85蛋白能够有效抑制MOI 1 ALV-A重组病毒RCASBP(A)-Mcherry的感染。将RCASBP(A)-Mcherry接种DF-1/K-gp85并连续传20代,通过测序共检测到7个ALV-A gp85突变位点(第5代:S^(272)N、P^(280)L和F^(288)S;第10代:L^(154)P;第15代:T^(127)A;第20代:L^(154)P、R^(173)G和R^(212)H)。进一步表达野生型(wt)和L^(154)P突变的ALV-A gp85重组蛋白,将其分别与DF-1细胞孵育,然后接种MOI 0.1 RCASBP(A)-Mcherry,进行交叉干扰试验,流式细胞术检测结果显示,L^(154)P组Mcherry阳性细胞百分比显著高于ALV-A gp85wt组;另外构建L^(154)P突变的重组病毒载体RCASBP(A)-EGFP L^(154)P,将其与RCASBP(A)-EGFP分别转染DF-1细胞,5 d后经流式细胞术检测结果显示,RCASBP(A)-EGFP L^(154)P组EGFP阳性细胞百分比显著低于RCASBP(A)-EGFP组;进一步将0.1 MOI RCASBP(A)-EGFP L^(154)P和RCASBP(A)-EGFP重组病毒分别感染DF-1/K-gp85细胞系,7 d后采用ALV p27抗原ELISA检测结果显示,RCASBP(A)-EGFP L^(154)P组S/P值显著高于RCASBP(A)-EGFP组,提示RCASBP(A)-EGFP L^(154)P可能利用了其他受体侵入细胞。上述结果首次表明L^(154)是ALV-A结合Tva受体及启动感染的关键位点。本研究为阐明ALV-A gp85与细胞受体相互作用的分子机制奠定了基础。

关键词： A亚群禽白血病病毒 gp85 慢病毒载体交叉干扰突变

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鸡干扰素调节因子7的原核表达及多克隆抗体的制备

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动物医学进展 2013年第4期34卷 1-4页

作者：崔鹏飞邓国华韦良孟焦培荣廖明华南农业大学兽医学院广东广州510642 人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业部兽用疫苗创制重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东广州510642 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150001

为表达鸡干扰素调节因子7蛋白并制备其多克隆抗体,通过RT-PCR技术扩增chIRF7基因的编码序列,构建重组质粒PET30a-chIRF7。将重组质粒转化至大肠埃希菌(***)BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rchIRF7分子量约为60ku。将... 详细信息

为表达鸡干扰素调节因子7蛋白并制备其多克隆抗体,通过RT-PCR技术扩增chIRF7基因的编码序列,构建重组质粒PET30a-chIRF7。将重组质粒转化至大肠埃希菌(***)BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rchIRF7分子量约为60ku。将纯化的重组蛋白免疫接种小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA测定血清抗体滴度在1∶51 200以上,IFA检测结果显示制备的鼠抗chIRF7蛋白多抗能够与AIV刺激的CEF细胞内的chIRF7蛋白发生特异性反应,表明通过原核表达系统表达的重组蛋白rchIRF7具有很好的免疫原性,以其制备的鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗体滴度高、特异性好。

关键词：鸡干扰素调节因子7 原核表达多克隆抗体

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2012年-2013年我国集约化猪场猪伪狂犬病病毒感染情况的调查

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动物医学进展 2015年第3期36卷 133-136页

作者：张显浩陈瑞爱李冰蔡佳跃裴仉福刘好朋贺东生农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室肇庆大华农生物药品有限公司广东肇庆526238 华南农业大学兽医学院广东广州510642

为研究全国范围内中大型猪场猪伪狂犬病病毒(PRV)感染情况,在2012年—2013年,应用PCR方法及gE-ELISA试剂盒对采集自17个省126个集团或猪场的164份病料、2 212份血清进行猪伪狂犬病(PR)病原及血清野毒gE抗体的检测。结果表明,病料样品中,... 详细信息

为研究全国范围内中大型猪场猪伪狂犬病病毒(PRV)感染情况,在2012年—2013年,应用PCR方法及gE-ELISA试剂盒对采集自17个省126个集团或猪场的164份病料、2 212份血清进行猪伪狂犬病(PR)病原及血清野毒gE抗体的检测。结果表明,病料样品中,PRV野毒阳性率为34.1%,PRV野毒阳性猪场占检测猪场总数的38.6%;血清样品中,PRV野毒抗体阳性猪场48个,猪场阳性率为38.1%,总样品阳性率为14.96%;2013年的感染率比2012年的高,且冬、夏两季PRV野毒阳性率较高;保育猪的PRV野毒阳性率最高,为22.34%,种母猪群PRV野毒阳性率为14.32%;华东地区PRV阳性比例最高,南方地区的PRV野毒阳性率高于北方地区。通过本次调查,说明PRV在我国的猪场依然普遍存在,对猪场进行PR的控制和净化是非常必要的。

关键词：猪伪狂犬病病毒抗体聚合酶链反应酶联免疫吸附试验调查

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应用猪圆环病毒2型缺失NLS的Cap蛋白建立一种ELISA检测方法

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中国兽医杂志 2014年第3期50卷 14-17页

作者：张春雷陈春丽王强叶昱张杰谢康尚靳立明廖明樊惠英华南农业大学农业部兽用疫苗创制重点实验室兽医学院广东广州510642 广东大华农动物保健品股份有限公司广东新兴527400 广东华农温氏畜牧股份有限公司广东新兴527400

本试验通过诱导重组质粒pCold-SUMO-dCap在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性表达的SUMO-dCap融合蛋白,以SUMO-dCap融合蛋白作为包被抗原,建立了一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA方法.用该方法与商品化试剂盒对267份猪血清进行平行检测... 详细信息

本试验通过诱导重组质粒pCold-SUMO-dCap在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性表达的SUMO-dCap融合蛋白,以SUMO-dCap融合蛋白作为包被抗原,建立了一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA方法.用该方法与商品化试剂盒对267份猪血清进行平行检测,两种方法的符合率为90.26％,该方法的特异性和灵敏性分别为93.33％、97.16％;与猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒和猪瘟病毒阳性参考血清无交叉反应;批内和批间变异系数分别为1.25％～6.37％和6.68％～13.58％.研究结果表明,本试验建立的ELISA方法特异性强、敏感性好、重复性高,为临床上PCV2血清抗体检测和PCV2流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法,为商品化试剂盒开发奠定了良好的基础.

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白间接ELISA

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新型冠状病毒检测方法研究进展

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广东畜牧兽医科技 2022年第2期47卷 43-50,62页

作者：蔡琳琳梁健鹏陈礼斌向斌任涛华南农业大学兽医学院、华南农业大学兽医学院、农业农村部兽用疫苗创制重点实验室、人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室、广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东广州510640

新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)传播能力强,易感动物种类多。目前,已出现多种变异株,可能存在逃脱现有疫苗保护的风险。认识人与动物界及其与疾病传播的相关性仍然是许多新兴的人畜共患病... 详细信息

新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)传播能力强,易感动物种类多。目前,已出现多种变异株,可能存在逃脱现有疫苗保护的风险。认识人与动物界及其与疾病传播的相关性仍然是许多新兴的人畜共患病的关键控制点。本文简述了SARS-CoV-2的结构和突变毒株类型,并阐述了目前针对SARS-CoV-2的一系列检测手段的技术原理、特点,以及其应用现状,总结各方法的优缺点,最后提出完善常规疫病监测系统的建议,阐明对畜牧生物安全防控的重要意义。

关键词： SARS-CoV-2 COVID-19 qRT-PCR IAT 免疫检测生物安全

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一例鸡马立克氏病病毒和禽白血病病毒混合感染病例的实验室诊断与分析

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黑龙江畜牧兽医 2022年第2期 64-66,69,138页

作者：李芷珊陈俊宏徐玲玉张萌萌吴一凡柳腾飞王新凯宁章勇廖明贾伟新华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业农村部人畜共患病重点实验室/农业农村部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广州510642 岭南现代农业科学与技术广东省实验室广州510642

2020年11月份,江西省宜春市某散养鸡场50日龄鸡出现消化不良、精神萎靡、死前倒地抽搐并呈"劈叉姿势"症状,部分病鸡体表存在明显肿瘤。为了对发病鸡所患疾病进行诊断,采用发病情况调查、剖检病变、病理组织学观察及PCR检测方... 详细信息

2020年11月份,江西省宜春市某散养鸡场50日龄鸡出现消化不良、精神萎靡、死前倒地抽搐并呈"劈叉姿势"症状,部分病鸡体表存在明显肿瘤。为了对发病鸡所患疾病进行诊断,采用发病情况调查、剖检病变、病理组织学观察及PCR检测方法进行鉴定,同时对阳性条带测序比对,构建系统进化树。结果表明:剖检病死鸡可见心脏、肝脏、肾脏、肺脏有大量灰白色肿瘤灶,脾脏明显肿大。送检病料病理组织切片符合马立克氏病的病理特征;病原核酸检测显示马立克氏病病毒、禽白血病病毒和禽网状内皮组织增殖病病毒为阳性;阳性条带测序比对结果显示禽网状内皮组织增殖病病毒序列与马立克氏病流行毒株有高度相似性,为假阳性结果。说明该鸡场鸡群感染了马立克氏病病毒和禽白血病病毒,可采取改善养殖环境并结合疫苗免疫等方式科学防控,养鸡场应重视马立克氏病的实验室鉴别诊断和防控。

关键词：马立克氏病病理学鉴定鉴别诊断核酸检测肿瘤

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渔用疫苗佐剂的研究进展

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中国生物制品学杂志 2019年第4期32卷 476-481页

作者：谢华亮王庆王林川华南农业大学兽医学院广东广州510642 中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔药创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380

目前,我国水产养殖业已进入规模化、产业化模式,在水产动物疾病的困扰下,免疫防控是抵抗传染性疾病的有效方式之一。弱毒疫苗存在毒力返强的风险,传统的灭活疫苗和新兴的重组疫苗存在抗原量大、免疫持续期短、免疫效力低的问题,单独使... 详细信息

目前,我国水产养殖业已进入规模化、产业化模式,在水产动物疾病的困扰下,免疫防控是抵抗传染性疾病的有效方式之一。弱毒疫苗存在毒力返强的风险,传统的灭活疫苗和新兴的重组疫苗存在抗原量大、免疫持续期短、免疫效力低的问题,单独使用时不能达到理想的免疫效果。佐剂是一种先于抗原或与抗原同时使用的物质,可增强非特异性免疫反应,仅使用少量抗原即能达到理想的免疫效果,配比合适的疫苗佐剂可有效提高疫苗的保护力。本文就目前常见的渔用疫苗佐剂作一综述,为佐剂疫苗的研发提供参考。

关键词：渔用疫苗佐剂

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禽病防控中存在的几个关键问题与对策

禽病防控中存在的几个关键问题与对策

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第二届中国兽医大会暨中国兽医发展论坛

作者：廖明徐成刚辛朝安华南农业大学兽医学院农业部兽药创制重点实验室广州 510642

本文分析了当前我国禽病防控工作中存在的关键问题，包括从业人员对禽病复杂程度认识不够;养禽场缺乏生物安全防范意识，养殖管理不规范;病原变异频繁;新发传染病增多;多病原混合感染普遍;缺乏必要的实验室诊断技术和条件;缺乏优质高效... 详细信息

本文分析了当前我国禽病防控工作中存在的关键问题，包括从业人员对禽病复杂程度认识不够;养禽场缺乏生物安全防范意识，养殖管理不规范;病原变异频繁;新发传染病增多;多病原混合感染普遍;缺乏必要的实验室诊断技术和条件;缺乏优质高效的兽药、疫苗和诊断试剂;种禽场的重要疫病净化工作不到位;主管部门和行业协会的引导作用未完全发挥等。文章进一步针对这些问题提出了一系列改进措施，包括：建立科学、合理、健全的生物安全防控体系;坚持“加强管理，防重于治”的原则，确保各项防疫措施落实到位;制定合理的免疫程序，正确选择和使用有效的正规疫苗，加强免疫效果监测;生产单位与动物防疫行政管理部门共同建立疫病监测和诊断网络;妥善无害化处理病死禽及其废弃物，防止疫情在本地区内传播等。

关键词：家禽养殖禽病预防防治对策疫病监测

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新城疫病毒V和W基因真核表达产物对DF-1细胞凋亡的影响

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长江大学学报（自科版）（中旬） 2014年第8期11卷 38-41,6-7页

作者：汪招雄康银峰孙敏华高诗敏谢鹏任涛长江大学动物科学学院湖北荆州434025 农业部兽用疫苗重点创制实验室华南农业大学兽医学院广东广州510642

将含新城疫病毒（NDV）疫苗株LaSota和强毒株GM V和W基因的真核表达质粒pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V和pEGFP-GM W转染鸡胚成纤维细胞（DF-1）。转染24h后，用荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP在细胞中显著表达。分别于转染后24... 详细信息

将含新城疫病毒（NDV）疫苗株LaSota和强毒株GM V和W基因的真核表达质粒pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V和pEGFP-GM W转染鸡胚成纤维细胞（DF-1）。转染24h后，用荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP在细胞中显著表达。分别于转染后24、36h和48h用流式细胞仪测定表达产物对DF-1细胞凋亡的影响。结果表明，随着转染时间的增加，细胞早期凋亡率逐渐上升。在质粒转染后24h ， pEGFP-GM V、pEGFP-GM W、pEGFP-La V和pEGFP-La W真核表达产物诱导DF-1细胞的凋亡率在14 T.26％～17.09％之间，差异不大，但都明显高于空载体组。而在质粒转染后36h ，pEGFP-GM V、pEGFP-GM W真核表达产物诱导细胞凋亡率分别为45.05％和43.4％，明显高于pEGFP-La V 和pEG-FP-La W诱导的31.44％和38.64％的凋亡率。在质粒转染后48h ，pEGFP-GM W和pEGFP-La W真核表达产物诱导细胞凋亡率均超过50％， pEGFP-GM W 真核表达产物诱导细胞凋亡率达到了43.4％，而pEGFP-La V真核表达产物诱导细胞凋亡率最低，为33.44％。由此表明，来源于不同毒力 NDV毒株非结构蛋白V和W均能诱导早期细胞凋亡，但是诱导细胞凋亡能力存在一定的差异。

关键词：新城疫病毒 V基因 W基因真核表达细胞凋亡

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