探讨仙鹤草-黄连(Agrimoniae Herba-Coptidis Rhizoma,XHC-HL)含药血清通过溶酶体相关膜蛋白2A型(lysosome-associated membrane protein type 2A,LAMP2A)介导的自噬对人结直肠癌HT29和HCT116细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。通过生...
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探讨仙鹤草-黄连(Agrimoniae Herba-Coptidis Rhizoma,XHC-HL)含药血清通过溶酶体相关膜蛋白2A型(lysosome-associated membrane protein type 2A,LAMP2A)介导的自噬对人结直肠癌HT29和HCT116细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。通过生物信息学分析LAMP2A在结直肠癌发生发展中的作用机制;蛋白免疫印迹(Westem blot,WB)检测LAMP2A蛋白在结直肠癌细胞株中的表达;利用慢病毒转染技术构建LAMP2A干扰HT29及过表达HCT116结直肠癌细胞模型;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)实验检测转染效率;结直肠癌HT29和HCT116细胞分别给予不同浓度的仙鹤草-黄连含药血清,采用cell counting kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖,筛选含药血清最佳干预浓度及时间。将HT29细胞分为空白对照(NC)组、XHC-HL(仙鹤草-黄连药对处理)组、XHC-HL+shLAMP2A(仙鹤草-黄连药对处理+干扰LAMP2A)组;将HCT116细胞分为空白对照(NC)组、XHC-HL(仙鹤草-黄连药对处理)组、XHC-HL+LAMP2A(仙鹤草-黄连药对处理+过表达LAMP2A)组,CCK-8检测细胞活力;平板克隆实验检测细胞增殖能力;划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;WB技术和real-time qPCR技术检测仙鹤草-黄连药对对结直肠癌细胞LAMP2A、热休克同源蛋白70(heat shock cognate protein 70,HSC70)、热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的蛋白表达水平及mRNA的影响。通过差异表达分析发现结直肠癌患者相对于正常对照样本的LAMP2A表达水平有显著升高,生存分析提示伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)关键分子LAMP2A与结直肠癌的进展密切关联,通过基因集功能富集分析发现LAMP2A高表达患者显著上调了血管生成、免疫抑制等肿瘤进展相关信号通路,且免疫浸润分析发现LAMP2A高表达患者的肿瘤微环境会有更少的CD8 T细胞浸润。仙鹤草-黄连含药血清可以抑制HT29和HCT116细胞活力,最佳干预质量分数及时间为20%、48 h。与NC组相比,仙鹤草-黄连药对均可抑制HT29和HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,药对处理干扰LAMP2A组均能进一步抑制肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力并促进凋亡,而过表达LAMP2A可逆转含药血清处理后结直肠癌细胞被抑制的增殖、迁移、侵袭能力,减少细胞凋亡率。仙鹤草-黄连药对含药血清对CMA具有抑制作用,通过LAMP2A介导的自噬,上调LAMP2A、HSC70、HSP90蛋白和基因的表达,下调底物蛋白GAPDH的表达发挥抗结直肠癌功能。综上,仙鹤草-黄连药对可通过下调CMA关键分子蛋白LAMP2A表达,抑制CMA活性,从而抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭,并诱导细胞凋亡。
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