检索结果-内蒙古大学图书馆

MEKK2基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对MEKK2的表达抑制

中国细胞生物学学报 2012年第3期34卷 257-264页

作者：钱凤英兰风华董荔红黄俏佳南京军区福州总医院分子医学研究中心福州350025

设计并合成针对人MEKK2基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,将合成的互补片段退火后克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,并使其在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组。将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染293A细胞... 详细信息

设计并合成针对人MEKK2基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,将合成的互补片段退火后克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,并使其在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组。将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒。病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞,Western blot印迹法检测其对MEKK2表达的抑制。经酶切和测序鉴定均证实pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误。Western blot印迹检测结果显示,重组腺病毒表达载体可抑制MEKK2基因的表达,以pAd-MEKK2-siRNA2(针对MEKK2 cDNA 992-1 010的片段)抑制效果为最佳,pAd-MEKK2-siRNA1(针对MEKK2 cDNA 1 456-1 474的片段)和pAd-MEKK2-siRNA3(针对MEKK2 cDNA 1 351-1 369的片段)则未见明显的抑制效果。DNA Ladder和细胞存活测定结果表明,敲减MEKK2的表达后,AGS细胞接受H2O2刺激后的凋亡受到较强抑制、细胞存活数增加,明显高于野生型细胞和转导siRNA阴性对照腺病毒细胞接受H2O2刺激后的,差异具有统计学意义(P<0.05),而后两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。该研究成功地构建了针对MEKK2基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步深入研究MEKK2基因在人胃腺癌细胞中的作用和功能奠定了基础。

关键词：腺病毒载体 RNA干扰 MEKK2基因 H2O2 细胞凋亡

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AKT2基因的过表达抑制H_2O_2诱导的乳腺癌细胞凋亡

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中国生物化学与分子生物学报 2011年第11期27卷 1044-1050页

作者：凌彩虹兰风华韩俊勇董荔红黄俏佳南京军区福州总医院分子医学研究中心福州350025

研究AKT2基因对H2O2诱导的乳腺癌细胞凋亡的影响.RT-PCR扩增人AKT2基因全长cDNA序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,构建AKT2基因的真核表达载体(野生型,WT-AKT2);应用QuikChange定点诱变,制备AKT2激酶活性丧失的负性表达载体(DN-A... 详细信息

研究AKT2基因对H2O2诱导的乳腺癌细胞凋亡的影响.RT-PCR扩增人AKT2基因全长cDNA序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,构建AKT2基因的真核表达载体(野生型,WT-AKT2);应用QuikChange定点诱变,制备AKT2激酶活性丧失的负性表达载体(DN-AKT2).WT-AKT2和DN-AKT2分别转染人乳腺癌MCF-7细胞,新霉素筛选稳定转染细胞克隆;设计并合成针对人AKT2基因2个不同部位的siRNA片段,转染入同样的细胞.通过TUNEL和DNA ladder测定,研究转染AKT2基因及AKT2 siRNA前后细胞对H2O2诱导凋亡的抵抗作用.测序鉴定证实,WT-AKT2和DN-AKT2表达载体构建成功.Western印迹结果显示,WT-AKT2和DN-AKT2基因在MCF-7细胞中表达良好,而AKT2 siRNA则可有效地抑制AKT2的表达;TUNEL和DNA ladder测定结果表明,WT-AKT2表达上调的稳定克隆组,可显著提高MCF-7细胞对H2O2诱导的凋亡的抵抗作用(转染DN-AKT2具相反作用).经H2O2作用后,其凋亡细胞数显著低于空载体稳定转染克隆及未转染亲代细胞的,差异具有统计学意义(P<0.05),而后两者之间差异无统计学意义(P>0.05).AKT2抑制乳腺癌细胞对H2O2诱导凋亡的作用可被AKT2 siRNA和PI3K/AKT信号途径抑制剂wortmannin所阻断.内源性的结果进一步证明了AKT2的功能.本研究表明,AKT2能够抑制H2O2诱导的MCF-7人乳腺癌细胞凋亡,可能成为乳腺癌治疗的靶点之一,并为研究乳腺癌细胞抵抗活性氧诱导的细胞凋亡的分子机制奠定了基础.

关键词：人蛋白激酶Bβ 基因克隆 RNA干扰基因转染 H2O2 细胞凋亡

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X-连锁肾上腺-脑白质营养不良蛋白的结构与功能

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中国生物化学与分子生物学报 2009年第1期25卷 17-22页

作者：谢海花兰风华南京军区福州总医院分子医学研究中心福州350025

X-连锁肾上腺-脑白质营养不良基因(ALD基因)编码的ALD蛋白(ALDP)是4种人类ABCD转运蛋白之一,为一种半ABC转运蛋白,既有ABC(ATP binding cassette)转运蛋白的共有特征,又有过氧化物酶体膜蛋白的特点.其功能可能是将胞浆中极长链饱和脂肪... 详细信息

X-连锁肾上腺-脑白质营养不良基因(ALD基因)编码的ALD蛋白(ALDP)是4种人类ABCD转运蛋白之一,为一种半ABC转运蛋白,既有ABC(ATP binding cassette)转运蛋白的共有特征,又有过氧化物酶体膜蛋白的特点.其功能可能是将胞浆中极长链饱和脂肪酸(VLCFA)或其衍生物转运到过氧化物酶体内,并在其中进行β氧化.已报道的ALD基因突变有900多个,其后果多种多样,但最终都使VLCFA或其衍生物无法进入过氧化物酶体,从而使VLCFA在体内蓄积.作者认为,ALDP是研究ABCD转运蛋白,乃至所有ABC转运蛋白的一个极好模型.

关键词： X-连锁肾上腺-脑白质营养不良蛋白 ABC转运蛋白结构与功能

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一起死亡事故中难辨尸体的个体基因识别

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解放军医学杂志 2006年第10期31卷 994-996页

作者：兰风华郑德柱黄梁浒柯龙凤涂向东程烽王志红王水良张朵庄岳鹏董荔红南京军区福州总医院分子医学研究中心

目的对某地一起死亡事故中难辨认尸体进行个体基因识别。方法从遇难者尸体取深部肌肉和软骨组织少许。对部分组织进行常规病理检查。从尸体组织提取基因组DNA,采用荧光多重PCR技术,扩增尸体基因组DNA的16个短串联重复序列(STR)基因座。... 详细信息

目的对某地一起死亡事故中难辨认尸体进行个体基因识别。方法从遇难者尸体取深部肌肉和软骨组织少许。对部分组织进行常规病理检查。从尸体组织提取基因组DNA,采用荧光多重PCR技术,扩增尸体基因组DNA的16个短串联重复序列(STR)基因座。将遇难者STR基因型与父母的STR基因型进行比对,确定遇难者的家庭归属。结果常规病理检查示部分肌肉组织结构完全破坏,但软骨组织结构尚完整。肌肉组织基因组DNA的凝胶电泳呈3种类型:基本无降解、部分降解、完全降解。只有部分肌肉组织DNA可用于确定STR基因型,所有软骨的DNA样本均可用于STR-PCR。结论以STR基因型分析为基础的亲子鉴定技术是确定事故遇难者身份的有效方法。对腐烂尸体的STR分析而言,尸体软骨组织是首选。

关键词：事故 DNA指纹法 DNA 卫星聚合酶链反应

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TLR序列在SRP54蛋白与SRPRNA和信号肽结合中的作用

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中国生物化学与分子生物学报 2005年第6期21卷 781-785页

作者：黄俏佳兰风华董荔红朱忠勇南京军区福州总医院分子医学研究中心福州350025

SRP54蛋白是信号识别颗粒(signal recognition particle)的一个关键组分.对人SRP54蛋白328～330位的TLR3个氨基酸进行人工诱变,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达了A3突变体,并对A3突变体进行纯化和Superdex75凝胶过滤分析.观察到A3突变... 详细信息

SRP54蛋白是信号识别颗粒(signal recognition particle)的一个关键组分.对人SRP54蛋白328～330位的TLR3个氨基酸进行人工诱变,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达了A3突变体,并对A3突变体进行纯化和Superdex75凝胶过滤分析.观察到A3突变体丧失了与SRPRNA结合的能力,其自身也不能形成二聚体.结果证明,TLR这3个氨基酸残基与二聚体结构的形成有关,TLR是SRP54蛋白结合SRPRNA和新生蛋白质信号肽所必需的关键性氨基酸序列.

关键词：信号识别颗粒信号肽定点诱变凝胶过滤

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人精子特异性乳酸脱氢酶DNA疫苗的构建及免疫效果的初步研究

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第12期24卷 1204-1206页

作者：辛娜张朵陈平涂向东吴玉水兰风华南京军区福州总医院分子医学研究中心福建福州350025

目的:构建人精子特异性乳酸脱氢酶DNA疫苗,并免疫雌雄两性BALB/c小鼠,以观察特异性抗体的产生。方法:采用分子克隆的方法构建pVAX1-hLDHC DNA疫苗。双酶切及正反向测序对该DNA疫苗进行鉴定。肌肉注射方法免疫雌雄两性BALB/c小鼠,ELISA和... 详细信息

目的:构建人精子特异性乳酸脱氢酶DNA疫苗,并免疫雌雄两性BALB/c小鼠,以观察特异性抗体的产生。方法:采用分子克隆的方法构建pVAX1-hLDHC DNA疫苗。双酶切及正反向测序对该DNA疫苗进行鉴定。肌肉注射方法免疫雌雄两性BALB/c小鼠,ELISA和Western blot方法检测小鼠血清中的特异性抗体,常规病理学方法检测雄性实验小鼠的睾丸组织。结果:双酶切及正反向测序结果表明:插入片段的序列以及插入的位置和方向均正确。肌肉注射免疫BALB/c小鼠后可诱导明显的体液免疫反应,且在雄性实验小鼠中未观察到睾丸炎的发生。结论:成功构建了具有一定免疫效果的hLDHC DNA疫苗,为今后进行更深入的研究奠定了基础。

关键词：精子特异性乳酸脱氢酶 DNA疫苗基因免疫

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人甲胎蛋白基因启动子siRNA表达载体的构建及效应鉴定

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肿瘤 2007年第3期27卷 190-193页

作者：王水良庄岳鹏王志红兰风华南京军区福州总医院检验医学研究所分子医学研究中心福州350025

目的:探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性,为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究。方法:PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencerl．0-U6中以置换其U6启动子;依据hLRH-1基因RNA... 详细信息

目的:探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性,为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究。方法:PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencerl．0-U6中以置换其U6启动子;依据hLRH-1基因RNAi靶位点设计出siRNA模板DNA,体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链,再克隆构建成靶向人hLRH-1基因siRNA表达载体;脂质体转染法将上述重组质粒转入HepG2细胞中,实时定量PCR法初步分析所建系统在AFP表达细胞中触发靶基因hLRH-1的RNAi效应,以及hLRH-1调控下游靶基因的表达改变。结果:获得人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体pSiAFP。所建的RNAi载体系统可在表达AFP的HepG2细胞中有效诱导靶基因hLRtH-1表达下调,抑制率约达85%;同时调控hLRH-1下游靶基因CyclinE1与Oct 4的表达相应下调。结论:人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的HepG2细胞中有效介导靶基因的RNAi效应。

关键词：肝肿瘤实验性甲胎蛋白类 RNA干扰调控序列核酸 HepG2细胞

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AKTIP基因真核表达载体的构建及其在GES-1细胞中的表达

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第四军医大学学报 2008年第23期29卷 2127-2130页

作者：利荣乔黄俏佳南京军区福州总医院分子医学研究中心福建福州350025

目的:构建人蛋白激酶B相互作用蛋白(AKTIP)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体,观察其在GES-1细胞中的表达.方法:从健康人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增AKTIPcDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,经酶切鉴定及DN... 详细信息

目的:构建人蛋白激酶B相互作用蛋白(AKTIP)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体,观察其在GES-1细胞中的表达.方法:从健康人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增AKTIPcDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,经酶切鉴定及DNA测序证实后,应用脂质体将AKTIP基因转染入人胃黏膜细胞株GES-1细胞中,通过WesternBlot检测其在GES-1细胞中的表达情况.结果:重组载体经酶切鉴定和测序证实目的基因正确无误,WesternBlot结果显示AKTIP基因在GES-1细胞具有良好的表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1/myc-His(-)A-AKTIP真核表达载体,并成功地在GES-1细胞中进行了表达,为进一步研究AKTIP的功能和结构奠定了基础.

关键词：蛋白激酶B相互作用蛋白逆转录-PCR 基因克隆基因转染蛋白质印迹技术

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丝氨酸526位点在MEKK3介导的IL-1信号途径中的作用

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第四军医大学学报 2007年第21期28卷 1940-1943页

作者：黄俏佳兰风华朱忠勇董荔红南京军区福州总医院分子医学研究中心福建福州350025

目的:确定MEKK3分子中介导IL-1信号途径的关键性氨基酸.方法:对哺乳动物MEKK3活性环526位点的丝氨酸进行人工诱变后,用瞬时转染的方法分别将526A基因单独及与TRAF6基因同时导入GES-1细胞中;用免疫印迹、NF-κB荧光素酶报告基因测定及免... 详细信息

目的:确定MEKK3分子中介导IL-1信号途径的关键性氨基酸.方法:对哺乳动物MEKK3活性环526位点的丝氨酸进行人工诱变后,用瞬时转染的方法分别将526A基因单独及与TRAF6基因同时导入GES-1细胞中;用免疫印迹、NF-κB荧光素酶报告基因测定及免疫沉淀实验检测了526A突变体的表达水平、对IL-1及TRAF6介导的NF-κB基因的表达及MEKK3与TRAF6相互作用的影响.结果:通过与野生型MEKK3的对比,观察到526A不但阻断了IL-1及TRAF6介导的依赖于MEKK3的NF-κB基因的激活,同时阻断了TRAF6与MEKK3的相互作用.结论:526位点的丝氨酸在MEKK3介导的IL-1信号途径中起关键性的作用,是不可缺少的关键性氨基酸.

关键词：有丝分裂原激活的蛋白激酶 526A突变体 TRAF6 NF-KB 白细胞介素-1 信号传导

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人脐血间充质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的疗效

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实用儿科临床杂志 2008年第14期23卷 1090-1092页

作者：夏桂枝洪新如陈新民王水良兰风华南京军区福州总医院儿科福州350025 南京军区福州总医院妇产科福州350025 南京军区福州总医院分子医学研究中心福州350025

目的探讨脑内移植人脐血间充质干细胞(MSCs)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的治疗效果。方法无菌条件下收集20份健康足月新生儿脐血,采用密度梯度离心法分离出脐血单个核细胞,再通过贴壁细胞培养法培养出人脐血MSCs。选择P3代人脐血M... 详细信息

目的探讨脑内移植人脐血间充质干细胞(MSCs)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的治疗效果。方法无菌条件下收集20份健康足月新生儿脐血,采用密度梯度离心法分离出脐血单个核细胞,再通过贴壁细胞培养法培养出人脐血MSCs。选择P3代人脐血MSCs作为移植细胞,并经5-溴尿嘧啶脱氧核苷(BrdU)体外标记。7日龄SD大鼠30只制备HIBD模型,造模过程中死亡1只,剩余29只分为移植组(n=18)和对照组(n=11)。造模后第3天,在立体定位条件下,移植组大鼠经左侧大脑皮层注入人脐血MSCs,对照组在相同部位注入相同体积的PBS。在细胞移植后第7天,随机选择6只移植组大鼠处死取脑,通过脑组织免疫组织化学检测方法观察移植细胞在脑内的存活、迁移和分化情况。于移植后第1、7、14、21、28天采用改良神经功能损害评分(mNSS)方法对二组大鼠的神经功能进行评价。结果20份足月新生儿脐血中5份培养出人脐血MSCs,培养成功率为25%。移植组大鼠脑组织免疫组织化学检测发现移植细胞在脑内能够存活,并以移植点为中心向周围迁移,其中(12.67±2.73)%的移植细胞分化为星形胶质细胞样细胞,未发现移植细胞向神经元样细胞分化。mNSS检测结果显示,移植第1、7天移植组大鼠mNSS低于对照组,但差异无显著性意义(Pa>0.05),第14、21、28天移植组大鼠mNSS低于对照组,差异有显著性意义(Pa<0.05)。结论人脐血MSCs脑内移植对新生大鼠HIBD具有较好的治疗作用。

关键词：间充质干细胞人脐血脑损伤,缺氧缺血性移植

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