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福建医科大学学报 2005年第1期39卷 1-4页

作者：杨湘越兰小鹏朱忠勇颜宏利张毅孙树汉南京军区福州总医院全军医学检验中心(福建医科大学福总临床医学院) 福州350025 第二军医大学医学遗传学教研室上海200433

目的　研究毕赤酵母重组膜联蛋白 B1的特征变化 ,比较其和原核表达产物对血细胞凝集与血栓形成过程的影响。　方法　对毕赤酵母重组膜联蛋白 B1行 SDS- PAGE,等电聚焦 ,脱磷酸反应 ,蛋白质 N端氨基酸测序 ,白陶土部分凝血活酶时间 (KPTT... 详细信息

目的　研究毕赤酵母重组膜联蛋白 B1的特征变化 ,比较其和原核表达产物对血细胞凝集与血栓形成过程的影响。　方法　对毕赤酵母重组膜联蛋白 B1行 SDS- PAGE,等电聚焦 ,脱磷酸反应 ,蛋白质 N端氨基酸测序 ,白陶土部分凝血活酶时间 (KPTT)测定及大鼠下腔静脉血栓形成观察。　结果　毕赤酵母重组膜联蛋白 B1显示两条电泳带 ,其中一条带的相对分子质量比原核表达产物大 ,已被磷酸化 ,等电点较理论值低 ,两条带的 N端均携带了来自载体的 4个氨基酸 ,毕赤酵母重组膜联蛋白 B1和大肠杆菌谷胱甘肽转移酶融合膜联蛋白 B1具有明显的抗凝及抑制血栓形成作用。　结论　虽然毕赤酵母重组膜联蛋白 B1的分子特征较原核产物有了明显变化 ,但其抗凝及抑制血栓功能基本未受影响。

关键词：膜联蛋白原核表达产物血液凝固抗凝部分凝血活酶时间 KPTT 白陶土毕赤酵母等电点电泳

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人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶的可溶性表达及抗血清反应模式

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中华检验医学杂志 2004年第12期27卷 857-860页

作者：谢飞涂向东兰风华朱忠勇南京军区福州总医院解放军医学检验中心实验科福州350025

目的　克隆表达重组人I型丙氨酸氨基转移酶 (ALT1)蛋白及制备抗血清 ,探讨建立ALT1特异性检测方法思路。方法　逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增人ALT1cDNA ,插入pGEX 2T ,构建原核表达载体 pGEX 2T ALT1,并转入大肠杆菌进行表达。SDS P... 详细信息

目的　克隆表达重组人I型丙氨酸氨基转移酶 (ALT1)蛋白及制备抗血清 ,探讨建立ALT1特异性检测方法思路。方法　逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增人ALT1cDNA ,插入pGEX 2T ,构建原核表达载体 pGEX 2T ALT1,并转入大肠杆菌进行表达。SDS PAGE ,活力测定和活性染色鉴定表达产物。表达产物免疫小鼠所得抗血清对天然ALT1,重组ALT1及重组ALT2进行Westernblot分析。结果　重组质粒测序和酶切结果显示ALT1基因已经成功克隆到pGEX 2T载体。SDS PAGE和活性染色表明所表达蛋白具有天然活性。抗ALT1血清除识别重组ALT1外 ,还可识别天然蛋白和重组ALT2。结论　重组人ALT1得到高效可溶性表达。用目前方法制备的抗血清特异性不高 ,如建立ALT1的免疫学检测方法需要采用特异性识别ALT1的抗体 ,以避免交叉反应引起的假性升高。

关键词： ALT 丙氨酸氨基转移酶抗血清天然蛋白可溶性表达假性活性染色克隆表达特异性识别

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人胰腺α-淀粉酶的cDNA克隆和原核表达的初步研究

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中华检验医学杂志 2004年第7期27卷 452-455页

作者：涂向东谢飞兰风华朱忠勇南京军区福州总医院全军医学检验中心实验科

目的获得人胰腺α-淀粉酶(AMY2A)基因并进行原核表达。方法采用基因工程技术,根据人AMY2A基因序列设计并合成特异性引物;从人胰腺组织中提取总RNA,反转录成CDNA第一链;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺AMY2A基因,经BamH Ⅰ和Kpn... 详细信息

目的获得人胰腺α-淀粉酶(AMY2A)基因并进行原核表达。方法采用基因工程技术,根据人AMY2A基因序列设计并合成特异性引物;从人胰腺组织中提取总RNA,反转录成CDNA第一链;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺AMY2A基因,经BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切、连接并插入原核表达载体pGEX-5T,构建pGEX-5T-AMY2A重组表达载体,在大肠杆菌BL21中异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达AMY2A蛋白。包涵体经尿素变性、复性及谷胱苷肽琼脂糖柱亲和层析纯化、AMY2A酶活性测定和免疫印迹分析。结果重组质粒测序和酶切结果显示AMY2A基因已正确插入pGEX-5T,重组蛋白、复性及纯化产物SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在84 000处有一条明显的蛋白表达条带,AMY2A检测具有酶活性,免疫印迹分析表明重组蛋白具有人胰腺淀粉酶抗原性。结论作者已克隆并在大肠杆菌中初步表达并获得纯化的谷胱苷肽转移酶(GST)-AMY2A融合蛋白。

关键词：人胰腺α-淀粉酶 cDNA克隆原核表达基因工程技术纯化

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人Ⅱ型丙氨酸氨基转移酶表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

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临床检验杂志 2004年第4期22卷 273-275页

作者：谢飞涂向东兰风华朱忠勇南京军区福州总医院解放军医学检验中心实验科福州352200

目的　构建基因工程菌株 ,以获得重组人II型丙氨酸氨基转移酶 (ALT2 )蛋白。方法　逆转录PCR法从人肌肉组织总RNA中扩增ALT2基因片段 ,插入原核表达载体pET - 2 8a ,构建成融合表达质粒pET2 8 ALT2 ,将其转化大肠杆菌BL2 1DE3,IPTG诱导... 详细信息

目的　构建基因工程菌株 ,以获得重组人II型丙氨酸氨基转移酶 (ALT2 )蛋白。方法　逆转录PCR法从人肌肉组织总RNA中扩增ALT2基因片段 ,插入原核表达载体pET - 2 8a ,构建成融合表达质粒pET2 8 ALT2 ,将其转化大肠杆菌BL2 1DE3,IPTG诱导表达。SDS PAGE、活力测定、活性染色及westernblot鉴定表达产物。结果　重组质粒pET2 8 ALT2测序和酶切结果与预期完全符合。IPTG诱导后 ,阳性菌体裂解物上清ALT2活性很高 ,PAGE出现一分子量 5 80 0 0蛋白条带 ,可被抗ALT1抗血清识别 ,酶活性染色显示有ALT活性。结论　已成功将ALT2基因克隆到pET 2 8a载体 ,ALT2蛋白得到可溶性高效表达。

关键词：人Ⅱ型丙氨酸氨基转移酶表达载体构建大肠杆菌表达

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人氨肽酶N基因克隆和原核表达

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医学研究生学报 2004年第8期17卷 691-693页

作者：涂向东谢飞吴玉水兰风华朱忠勇南京军区福州总医院解放军医学检验中心实验科福建福州350025

目的 :构建人氨肽酶N(APN) 谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)融合蛋白 (APN GST) ,并进行原核表达。　方法 :根据人APNmRNA序列设计合成特异性引物 ,从人肝组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链 ,RT PCR扩增人APN基因 ,并插入融合蛋白原核表... 详细信息

目的 :构建人氨肽酶N(APN) 谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)融合蛋白 (APN GST) ,并进行原核表达。　方法 :根据人APNmRNA序列设计合成特异性引物 ,从人肝组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链 ,RT PCR扩增人APN基因 ,并插入融合蛋白原核表达载体 pGEX 4T ,转化宿主菌BL2 1(DE3)细胞 ,异丙基锍基半乳糖(IPTG)诱导表达APN蛋白。包涵体经尿素变性、重折叠和亲和层析纯化。　结果 :重组质粒测序和酶切结果显示 :APN基因已正确插入 pGEX 4T ,重组蛋白及纯化产物SDS PAGE在 135 0 0 0处有一条明显的蛋白表达条带。　结论 :人APN基因已被成功地克隆、表达和纯化。

关键词：氨肽酶N 基因克隆原核表达纯化

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肾上腺脑白质营养不良蛋白ATP结合区的原核表达与鉴定

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中国神经免疫学和神经病学杂志 2004年第2期11卷 107-110页

作者：黄梁浒郑德柱谢飞涂向东吴玉水兰风华南京军区福州总医院全军医学检验中心福建福州350025

目的　构建人肾上腺脑白质营养不良 ( adrenoleukodystrophy,ALD)蛋白 ( ALD protein,ALDP) ATP结合区的原核重组载体并进行表达和鉴定。方法　自行设计引物 ,通过 PCR技术 ,以人全血 RNA为模板扩增ALDP ATP结合区编码序列 ,PCR产物经 E... 详细信息

目的　构建人肾上腺脑白质营养不良 ( adrenoleukodystrophy,ALD)蛋白 ( ALD protein,ALDP) ATP结合区的原核重组载体并进行表达和鉴定。方法　自行设计引物 ,通过 PCR技术 ,以人全血 RNA为模板扩增ALDP ATP结合区编码序列 ,PCR产物经 Eco R /Xho 双酶切后 ,将其克隆至 p GEX-4T-2载体中 ,在大肠杆菌 BL2 1中诱导 GST融合蛋白的表达。结果　在 IPTG的诱导下 ,重组菌高效表达出一相对分子质量约为42 0 0 0的产物 ,与预期大小相符。对重组质粒的序列分析表明 ,插入片段的序列与 Genbank登录的编码序列完全一致。Western blot结果显示 ,目的条带可被鼠抗人 ALDP单克隆抗体识别。结论　人 ALDP ATP结合区的编码序列已被克隆至 GST融合表达载体 p GEX-4T-2 ,并在大肠杆菌 BL2 1中获得高表达。

关键词：肾上腺脑白质营养不良 ALD ATP结合区原核表达单克隆抗体

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蛋白芯片法检测多肿瘤标志物的临床应用

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医学研究生学报 2004年第8期17卷 716-719页

作者：兰小鹏赵猛马立强薛昭卿南京军区福州总医院解放军医学检验中心福建福州350025

目的 :探讨多肿瘤标志物联合检测在肺癌、肝癌、胰 /结直肠癌及胃癌等四种肿瘤中的临床应用价值。　方法 :采用多肿瘤标志物蛋白芯片法 (C 12系统 )联合检测 30例肺癌、19例肝癌、2 4例胰 /结直肠癌和 2 2例胃癌及173例良性疾病患者 ,... 详细信息

目的 :探讨多肿瘤标志物联合检测在肺癌、肝癌、胰 /结直肠癌及胃癌等四种肿瘤中的临床应用价值。　方法 :采用多肿瘤标志物蛋白芯片法 (C 12系统 )联合检测 30例肺癌、19例肝癌、2 4例胰 /结直肠癌和 2 2例胃癌及173例良性疾病患者 ,并对结果进行敏感度 /特异性 (ROC)分析。　结果 :C 12系统中单个标志物在四种肿瘤中的检出率与文献报道无显著差异 ;肿瘤组的阳性率明显高于非肿瘤组 (分别为 85 .3%和 18.5 % ;P <0 .0 0 1) ,而且肿瘤组阳性平均值明显高于非肿瘤组 (P <0 .0 1) ;系统整体ROC曲线下面积明显大于任何单项标志物。　结论 :C 12系统在肿瘤标志物检测上有较高的灵敏度和较好的特异性 ,其临床应用价值较高。

关键词：肿瘤标志物蛋白芯片 ROC

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男性常染色体平衡易位三例

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中华医学遗传学杂志 2004年第3期21卷 256-256页

作者：涂向东张宝珍南京军区福州总医院全军医学检验中心实验科细胞遗传室福州350025

例1 男,32岁,结婚5年不育,非近亲结婚.查体:患者表型正常,精液常规检查两次均为无精.Y染色体微缺失筛查:

关键词：男性常染色体平衡易位 Y染色体微缺失性别决定区Y

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人I型丙氨酸氨基转移酶的可溶性表达及抗血清反应模式

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药物不良反应杂志 2004年第12期 860-860页

目的克隆表达重组人I型丙氨酸氨基转移酶(ALT1)蛋白及制备抗血清,探讨建立ALT1特异性检测方法思路.方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人ALT1 cDNA,插入pGEX-2T,构建原核表达载体pGEX-2T-ALT1,并转入大肠杆菌进行表达.SDS-PAGE,活力测... 详细信息

目的克隆表达重组人I型丙氨酸氨基转移酶(ALT1)蛋白及制备抗血清,探讨建立ALT1特异性检测方法思路.方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人ALT1 cDNA,插入pGEX-2T,构建原核表达载体pGEX-2T-ALT1,并转入大肠杆菌进行表达.SDS-PAGE,活力测定和活性染色鉴定表达产物.表达产物免疫小鼠所得抗血清对天然ALT1, 重组ALT1及重组ALT2进行Western blot分析.结果重组质粒测序和酶切结果显示ALT1基因已经成功克隆到pGEX-2T载体.SDS-PAGE和活性染色表明所表达蛋白具有天然活性.抗ALT1血清除识别重组ALT1外,还可识别天然蛋白和重组ALT2. 结论重组人ALT1得到高效可溶性表达.用目前方法制备的抗血清特异性不高,如建立ALT1的免疫学检测方法需要采用特异性识别ALT1的抗体,以避免交叉反应引起的假性升高。

关键词：丙氨酸氨基转移酶克隆,分子

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大血小板检测及临床意义探讨

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临床检验杂志 2003年第1期21卷 17-18页

作者：林宝顺郑德柱刘文星林祥泉南京军区福州总医院全军医学检验中心福州350025 福建医科大学检验系

目的　评价ADVIA 12 0血液分析仪对大血小板的检测及大血小板的临床意义。方法　将富含大血小板标本分别用免疫学法、手工法、ADVIA 12 0和Coulter JT血液分析仪计数血小板 ,以免疫学法结果为参考值 ,比较手工法、ADVIA 12 0和Coulter J... 详细信息

目的　评价ADVIA 12 0血液分析仪对大血小板的检测及大血小板的临床意义。方法　将富含大血小板标本分别用免疫学法、手工法、ADVIA 12 0和Coulter JT血液分析仪计数血小板 ,以免疫学法结果为参考值 ,比较手工法、ADVIA 12 0和Coulter JT与免疫学法的相关性 ;临床分析 2 90例大血小板标本。结果　 3种方法与免疫学法比较的相关系数分别为 0 .812 1、0 .930 6和 0 .76 6 9;妊娠和恶性肿瘤患者大血小板分别占 17.9%和 2 0 .0 %。结论　ADVIA 12 0血液分析仪是目前检测血小板较理想的仪器之一 ;

关键词：大血小板血小板计数相关性临床意义检测

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