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南京农业大学学报 2017年第6期40卷 971-976页

作者：周道云肖栋申浩冉高立伟侯喜林南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室江苏南京210095

[目的]本文旨在研究白菜类作物开花时间候选基因***.a的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记开发与利用。[方法]PCR扩增2个亲本的***.a基因外显子2到内含子2区域的特异序列,开发CAPS标记***.a-NlaⅢ,用CAPS标记对F2分离群体的基因型进行检测,... 详细信息

[目的]本文旨在研究白菜类作物开花时间候选基因***.a的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记开发与利用。[方法]PCR扩增2个亲本的***.a基因外显子2到内含子2区域的特异序列,开发CAPS标记***.a-NlaⅢ,用CAPS标记对F2分离群体的基因型进行检测,并进行Pearson相关性分析研究基因型与开花时间表现型的关系。[结果]通过调查亲本早开花油用型品种‘Yellow sarson’材料YS-143和晚开花芜菁品种‘Vegetable turnip’材料VT-044的开花时间和F2群体的开花时间,发现两亲本的开花时间存在显著性差异。通过PCR扩增克隆了两亲本的***.a基因的特异序列,并在突变位点T-A处开发出CAPS标记***.a-NlaⅢ。在136份F_2分离群体上进行此CAPS标记的验证后,发现T基因型开花时间晚于A基因型的开花时间,并且差异显著(P<0.05)。[结论]***.a基因的CAPS标记***.a-NlaⅢ与开花时间表型显著相关,该标记可以用作开花时间的分子选择辅助育种。

关键词：白菜类作物开花时间 BraA.FLM.a CAPS标记

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不结球白菜开花基因BcFT的亚细胞定位及其互作蛋白的筛选

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南京农业大学学报 2017年第4期40卷 592-600页

作者：张蓓刘同坤黄菲艺邵帅旭吴小婷侯喜林南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室江苏南京210095

[目的]开花基因FT是开花通路下游关键基因。本文旨在研究不结球白菜BcFT的亚细胞定位及互作蛋白的筛选,深入了解不结球白菜BcFT的功能及其调控机制。[方法]构建亚细胞定位载体p EZS-NL-BcFT,利用亚细胞定位技术研究BcFT的空间表达。通... 详细信息

[目的]开花基因FT是开花通路下游关键基因。本文旨在研究不结球白菜BcFT的亚细胞定位及互作蛋白的筛选,深入了解不结球白菜BcFT的功能及其调控机制。[方法]构建亚细胞定位载体p EZS-NL-BcFT,利用亚细胞定位技术研究BcFT的空间表达。通过酵母双杂交技术筛选与BcFT互作的蛋白,构建酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-BcFT,转化酵母Y2H Gold菌株,验证自激活性和自毒性。对不结球白菜酵母双杂交c DNA文库进行筛选,得到与BcFT互作的片段,并根据基因片段进行比对,以不结球白菜c DNA为模板进行基因全长克隆,构建p GADT7载体,进行共转化验证,最后对筛选得到的2个蛋白进行生物信息学分析。[结果]BcFT蛋白在整个细胞中均有分布。诱饵载体p GBKT7-BcFT表达产物对酵母细胞无自激活性和自毒性,通过酵母双杂交及共转验证得到2个与BcFT互作的蛋白:Bc PPD5和Bc VHA-E1。生物信息学分析预测这2个蛋白均为亲水性蛋白,不含信号肽,Bc PPD5蛋白的氨基酸序列存在1个跨膜区,二级结构中不规则卷曲所占比例最大,第163和296氨基酸残基之间存在1个Psb P结构域;Bc VHA-E1蛋白无跨膜区,二级结构中α螺旋所占比例最大,无特定结构域。[结论]确定了BcFT蛋白在整个细胞中均有表达。利用酵母双杂交技术筛选得到2个与BcFT互作蛋白,进一步分析发现其可能通过光周期路径影响开花。

关键词：不结球白菜 BcFT 亚细胞定位酵母双杂交

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不结球白菜过氧化还原蛋白基因Brc2-Cys Prx的克隆和表达分析

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南京农业大学学报 2017年第1期40卷 40-47页

作者：刘世拓肖栋许玉超侯喜林徐玮玮韩克董慧杰胡春梅南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室/园艺学院江苏南京210095

[目的]双半胱氨酸型硫氧还蛋白过氧化物酶Brc2-Cys Prx是过氧化还原蛋白Peroxiredoxins(Prxs)的亚家族。Prxs是植物抗氧化酶防御系统的成员,对清除植物体内活性氧具有重要作用。本文旨在克隆和研究Brc2-Cys Prx基因在不结球白菜处于不... 详细信息

[目的]双半胱氨酸型硫氧还蛋白过氧化物酶Brc2-Cys Prx是过氧化还原蛋白Peroxiredoxins(Prxs)的亚家族。Prxs是植物抗氧化酶防御系统的成员,对清除植物体内活性氧具有重要作用。本文旨在克隆和研究Brc2-Cys Prx基因在不结球白菜处于不同胁迫条件下的表达模式。[方法]以不结球白菜霜霉病抗病自交系‘苏州青’和霜霉病感病自交系‘矮脚黄’为试验材料,利用RACE技术克隆得到不结球白菜Brc2-Cys Prx基因。利用生物信息学方法对该基因进行信息学分析。采用qRT-PCR技术对不结球白菜叶片Brc2-Cys Prx基因在霜霉病菌侵染及NaCl、CdCl_2、PEG6000和ABA等非生物胁迫处理条件下的表达模式进行研究。[结果]Brc2-Cys Prx基因的c DNA全长为999 bp,其中开放阅读框长度为810 bp,共编码270个氨基酸。该蛋白不存在信号肽序列,预测相对分子质量为28.15×10~3,理论等电点为5.87。不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。该蛋白含有1个PRX_Typ2cys结构域,属于硫氧还蛋白超家族。系统进化分析表明:不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜和甘蓝型油菜进化关系最近。霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx基因表达呈逐渐上调趋势,在‘矮脚黄’中的表达与‘苏州青’相比上调迟钝,且该基因在‘矮脚黄’中的表达量一直低于‘苏州青’。0.2 mol·L^(-1)NaCl和200 g·L^(-1)PEG6000处理抑制Brc2-Cys Prx基因的表达;150μmol·L^(-1)CdCl_2处理促进Brc2-Cys Prx基因的表达,在24 h达到最大值;100μmol·L^(-1)ABA处理后,Brc2-Cys Prx基因表达上调,而12 h后,表达受抑制。[结论]霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx在抗性系‘苏州青’和感病系‘矮脚黄’中的表达存在差异,并且在抗病系中的表达量较高,推测Brc2-Cys Prx基因的高转录水平是抗病品种较之感病品种对霜霉病菌侵染具有更高抗性的原因之一。在非生物胁迫条件下,Brc2-Cys Prx基因具有不同的应答模式,推测可能是涉及到不同的物质或信号途径的原因。

关键词：不结球白菜霜霉病菌活性氧抗氧化防御系统 Brc2-Cys Prx基因基因表达

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不结球白菜BcOPR3基因的克隆与功能分析

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南京农业大学学报 2017年第5期40卷 804-811页

作者：文锴王远胡蝶袁敬平侯喜林李英南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室/南京农业大学园艺学院江苏南京210095

[目的]12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxo-phytodienoic acid reductase,OPR)是茉莉酸生物合成途径的关键酶,催化12-氧-植物二烯(OPDA)还原反应生成茉莉酸化合物,广泛参与植物生长过程中的防御系统。本文旨在克隆和研究不结球白菜Bc OPR3基... 详细信息

[目的]12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxo-phytodienoic acid reductase,OPR)是茉莉酸生物合成途径的关键酶,催化12-氧-植物二烯(OPDA)还原反应生成茉莉酸化合物,广泛参与植物生长过程中的防御系统。本文旨在克隆和研究不结球白菜Bc OPR3基因,研究其对信号分子和非生物胁迫应答的影响。[方法]对不结球白菜OPR3基因进行克隆、生物信息分析、亚细胞定位,并对其在霜霉病菌、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、机械伤害、低温和热激胁迫下的表达水平进行了分析。[结果]Bc OPR3在2个不结球白菜品种中的序列一致,其Bc OPR3蛋白与同科油菜(Brassica napus)的同源性高达98%,进化关系与之最相近;亚细胞定位结果显示Bc OPR3定位在细胞膜上;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测结果表明,不结球白菜霜霉病菌、ABA、JA、SA、机械伤害、低温和热激胁迫均能诱导Bc OPR3基因表达。霜霉病菌侵染下,Bc OPR3在抗性自交系‘苏州青’和感病自交系‘矮脚黄’中存在差异表达,并且在抗病自交系中表达量较高。[结论]从不结球白菜克隆得到的Bc OPR3,通过表达分析发现,Bc OPR3可能存在对非生物胁迫的共响应,且在不结球白菜中该基因是在细胞膜上起作用。在非生物胁迫下,基因具有不同的应答模式,抗性自交系Bc OPR3基因的高表达是其具有更高抗性的主要原因。

关键词：不结球白菜 BcOPR3 克隆亚细胞定位 RT-qPCR

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不结球白菜BrCDF1的克隆和蛋白亚细胞定位及其与BrFKF1蛋白的互作验证

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南京农业大学学报 2017年第5期40卷 812-819页

作者：吴小婷邵帅旭李英张昌伟侯喜林沈振国刘同坤南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室江苏南京210095 南京农业大学生命科学学院江苏南京210095

[目的]本文旨在揭示CDF1基因在不结球白菜(Brassica rapa ***)抽薹开花过程中的调控机制,验证其是否与FKF1蛋白发生互作。[方法]以‘苏州青’为材料,采用同源克隆方法获得BrCDF1基因全长序列,并与其他物种进行氨基酸序列比对;将BrCDF1... 详细信息

[目的]本文旨在揭示CDF1基因在不结球白菜(Brassica rapa ***)抽薹开花过程中的调控机制,验证其是否与FKF1蛋白发生互作。[方法]以‘苏州青’为材料,采用同源克隆方法获得BrCDF1基因全长序列,并与其他物种进行氨基酸序列比对;将BrCDF1与报告基因YFP融合构建亚细胞定位载体p Early Gate101-BrCDF1-YFP,采用农杆菌介导的方法将其瞬时表达于本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中;激光共聚焦显微镜观察,利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证不结球白菜BrCDF1和BrFKF1蛋白是否存在互作。[结果]BrCDF1基因含有876 bp开放阅读框,编码292个氨基酸。与甘蓝型油菜(Brassica napus)、野甘蓝(原变种)(Brassica oleracea ***)、萝卜(Raphanus sativus)的氨基酸序列比对结果显示:BrCDF1在进化过程中的保守程度分别为91.11%、88.25%、84.76%,保守性较高。BrCDF1蛋白定位于细胞核中,BrCDF1和BrFKF1之间存在相互作用。[结论]BrCDF1定位于细胞核,并且与BrFKF1互作,在进化过程中保守性较高,并可能参与了不结球白菜的光周期开花途径。

关键词：不结球白菜 BrCDF1 亚细胞定位酵母双杂交双分子荧光互补

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全基因组分析鉴定正向选择基因并揭示其在白菜基因组中的分布、表达和甲基化概况

全基因组分析鉴定正向选择基因并揭示其在白菜基因组中的分布、表...

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中国作物学会油料作物专业委员会第八次会员代表大会暨学术年会

作者：郭月刘静彭珍李英候喜林杜建厂江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所江苏省农业生物学重点实验室江苏省农业科学院经济作物研究所农业部长江下游棉花与油菜重点实验室江苏省现代作物生产协同创新中心南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室

普遍认为,正向选择是生物机体表型多样化背后的主要进化力量之一。然而,正向选择基因的特征性质尚缺乏具体详细的研究。本研究中,我们对白菜和甘蓝间的直系同源基因进行了全基因组分析,最终得到468个潜在的正向选择基因。结果表明:(1)... 详细信息

普遍认为,正向选择是生物机体表型多样化背后的主要进化力量之一。然而,正向选择基因的特征性质尚缺乏具体详细的研究。本研究中,我们对白菜和甘蓝间的直系同源基因进行了全基因组分析,最终得到468个潜在的正向选择基因。结果表明:(1)正向选择基因在植物激素信号转导途径以及转录因子家族中富集;(2)正向选择基因的表达水平显著低于随机选取的非正向选择对照组基因;(3)具有组织表达特异性的正向选择基因在愈伤和生殖组织(花和角果)中的表达量显著高于营养组织(根、茎和叶);(4)正向选择基因的比例与三倍化基因保留的拷贝数正相关,但正向选择基因的表达水平却随着三倍化基因拷贝数的增加而降低;(5)正向选择基因在内含子区域的CG和CHG甲基化水平显著高于启动子和外显子区域;(6)转座元件的百分比与正向选择基因的甲基化水平成正比,DNA的甲基化(尤其是CG背景)具有降低正向选择基因表达量的趋势。本研究为进一步了解白菜正向选择基因的特征、演化、功能、表达以及甲基化提供了理论依据。

关键词：正向选择基因分布表达甲基化白菜

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不结球白菜农杆菌介导离体转化法研究

不结球白菜农杆菌介导离体转化法研究

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第八届全国植物组培脱毒快繁及工厂化种苗生产技术学术研讨会

作者：高立伟杨洋张昌伟侯喜林南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室南京210095

本文论述了获得转基因不结球白菜的转化和再生程序,通过对组织培养体系优化增加白菜再生频率.使用pCas9介导的不结球白菜基因编辑载体,含有除草剂抗性基因筛选的根癌土壤杆菌菌株GV3101与苏州青的下胚轴外植体共培养.在共培养的3个月内... 详细信息

本文论述了获得转基因不结球白菜的转化和再生程序,通过对组织培养体系优化增加白菜再生频率.使用pCas9介导的不结球白菜基因编辑载体,含有除草剂抗性基因筛选的根癌土壤杆菌菌株GV3101与苏州青的下胚轴外植体共培养.在共培养的3个月内获得转化的植物,通过除草剂Bar基因抗性筛选,阳性植株PCR验证得到转基因植株,为不结球白菜通过基因工程进行遗传改良提供了良好的技术支持.

关键词：不结球白菜组织培养离体转化法农杆菌介导

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芹菜AgERF4转录因子基因的克隆与表达分析

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园艺学报 2016年第11期43卷 2193-2202页

作者：吴蓓李梦瑶王广龙黄蔚王枫熊爱生南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室南京210095

以‘六合黄心芹’芹菜为材料,克隆出编码乙烯反应元件结合蛋白基因AgERF4。序列分析表明,AgERF4含有1个长度为597 bp的开放阅读框,编码198个氨基酸,预测其蛋白质相对分子质量为21.43 kD,等电点为8.51。进化分析表明,ERF4转录因子在植物... 详细信息

以‘六合黄心芹’芹菜为材料,克隆出编码乙烯反应元件结合蛋白基因AgERF4。序列分析表明,AgERF4含有1个长度为597 bp的开放阅读框,编码198个氨基酸,预测其蛋白质相对分子质量为21.43 kD,等电点为8.51。进化分析表明,ERF4转录因子在植物中高度保守。AgERF4属于亲水性蛋白。酵母单杂交和β–半乳糖苷酶活性测定结果确定AgERF4转录因子和乙烯应答元件GCC Box具有较高的结合活性。RT-qPCR分析表明,AgERF4在芹菜叶片中的表达水平较高,在根和叶柄中表达水平较低;高温和干旱条件下AgERF4的表达呈先上升后下降的趋势,在盐处理的24 h内AgERF4的表达始终高于对照。AgERF4转录因子在芹菜非生物逆境胁迫调控过程中起着重要作用。

关键词：芹菜乙烯反应元件结合蛋白酵母单杂交非生物胁迫基因表达

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芸薹属作物游离小孢子培养研究进展

芸薹属作物游离小孢子培养研究进展

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第八届全国植物组培脱毒快繁及工厂化种苗生产技术学术研讨会

作者：张娅梁超凡黄天虹刘同坤侯喜林李英作物遗传与种质创新国家重点实验室农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室南京农业大学园艺学院南京210095

本文对影响芸薹属作物游离小孢子培养胚胎发生的主要因素、影响小孢子植株再生的因素、小孢子植株倍性鉴定以及该技术的应用情况进行了总结,对今后的研究方向进行了展望,以期对芸薹属作物游离小孢子培养提供帮助.

关键词：芸薹属作物游离小孢子组织培养胚胎发生植株再生

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芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT基因的克隆及表达特性分析

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植物资源与环境学报 2016年第3期25卷 19-27页

作者：苑笑阳吴雪君聂力许珂熊爱生南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室江苏南京210095

根据伞形科(Apiaceae)植物芹菜(Apium graveolens Linn.)的转录组数据库,从芹菜品种‘六合黄心芹’(‘Liuhe Huangxinqin’)叶片总RNA中克隆获得咖啡碱-辅酶A-O-甲基转移酶基因,命名为Ag CCo AOMT基因。序列分析结果表明:Ag CCo AOMT基... 详细信息

根据伞形科(Apiaceae)植物芹菜(Apium graveolens Linn.)的转录组数据库,从芹菜品种‘六合黄心芹’(‘Liuhe Huangxinqin’)叶片总RNA中克隆获得咖啡碱-辅酶A-O-甲基转移酶基因,命名为Ag CCo AOMT基因。序列分析结果表明:Ag CCo AOMT基因包含1个长度726 bp的开放阅读框(ORF),编码241个氨基酸;该基因编码的蛋白质为Ag CCo AOMT,其理论相对分子质量为27 010,理论等电点p I 5.35;在Ag CCo AOMT蛋白中,酸性氨基酸所占比例高于碱性氨基酸,脂肪族氨基酸所占比例约为芳香族氨基酸的3倍;该蛋白属于疏水性蛋白,并含有1个保守的Ado Met_MTases结构域,说明Ag CCo AOMT蛋白属于Ado Met_MTases超级家族;Ag CCo AOMT蛋白的三级结构包含多个α-螺旋和β-折叠,与紫花苜蓿(Medicago sativa Linn.)CCo AOMT蛋白三级结构的一致性为84.58%。多重比对和系统树分析结果表明:Ag CCo AOMT蛋白有较高的保守性;该蛋白与同科植物大阿米芹(Ammi majus Linn.)和欧芹〔Petroselinum crispum(Mill.)Nyman ex ***〕CCo AOMT蛋白的进化关系最近,与睡莲科(Nymphaeaceae)植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)CCo AOMT蛋白的进化关系较近。qRT-PCR检测结果表明:Ag CCo AOMT基因能够在‘六合黄心芹’的根、茎、叶柄和叶片中表达,且在叶片中的相对表达量极显著(P<0.01)高于其他组织,说明该基因的表达具有明显的组织特异性;不同生长发育阶段该基因在叶片中的相对表达量有明显差异,其在商品期(播种后第65天)的相对表达量极显著高于幼苗期(播种后第25天)和生长旺盛期(播种后第45天)。研究结果显示:Ag CCo AOMT基因与‘六合黄心芹’叶的老化和木质素含量升高有关,且在进化过程中具有较高的保守性。

关键词：芹菜 AgCCoAOMT基因序列分析多重比对表达特性

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