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第四届全国发酵工程学术研讨会

作者：邓海华曹慧李晓丹王世明崔中利李顺鹏南京农业大学生命科学学院微生物学系农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA中,从大约8,000个突变子中筛选到1株在LB培养基上积累红褐色物质的突变株M18,该突变株不能以L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine,Phe)为唯一碳源生长.SEFA-PCR扩增转座子侧翼... 详细信息

通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA中,从大约8,000个突变子中筛选到1株在LB培养基上积累红褐色物质的突变株M18,该突变株不能以L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine,Phe)为唯一碳源生长.SEFA-PCR扩增转座子侧翼序列发现其与已报道的尿黑酸1,2-双加氧酶基因hmgA的同源性为92％.将hmgA定向克隆至表达载体pET-29a中,转化至Escherichia coli BL21,经IPTG诱导后可表达分子量约为48kD的蛋白;诱导后转化子粗酶液对尿黑酸有很好的降解效果.将hmgA连入自杀性载体pEX19Gm,通过同源重组整合至M18染色体中,使其恢复了DLL-E4利用Phe的能力,证实了HmgA是尿黑酸苯环裂解酶.

关键词：转座子标签法同源重组基因敲入单胞菌尿黑酸克隆

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酿酒酵母鲨烯单加氧酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

酿酒酵母鲨烯单加氧酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

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首届全国食用菌中青年专家学术交流会

作者：李娜赵明文南京农业大学生命科学学院农业部农业微生物环境工程重点开放实验室南京农业大学生命科学学院农业部农业微生物环境工程重点开放实验室

以酿酒酵母鲨烯单加氧酶基因的全长质粒DNA为模板进行PCR扩增;将PCR产物克隆到巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-SE。重组质粒线性化后用电转化法导入毕赤酵母菌株GS11... 详细信息

以酿酒酵母鲨烯单加氧酶基因的全长质粒DNA为模板进行PCR扩增;将PCR产物克隆到巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-SE。重组质粒线性化后用电转化法导入毕赤酵母菌株GS115中,经大量筛选,及PCR验证获得在染色体上整合有目的基因的菌株,取上清液进行SDS-PAGE 电泳可以检测到目的条带。

关键词：鲨烯单加氧酶载体构建分泌表达

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环境中污染物降解基因的水平转移(HGT)及其在生物修复中的作用

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遗传 2005年第5期27卷 845-851页

作者：张瑞福蒋建东代先祝顾立锋李顺鹏南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

水平基因转移是不同于垂直基因转移的遗传物质的交流方式。在污染环境这一特异生态环境中,降解基因的水平转移有着独特的功能与作用。研究环境中污染物降解基因在微生物间的水平转移,更深入地了解微生物种群适应污染环境的机理,对于评... 详细信息

水平基因转移是不同于垂直基因转移的遗传物质的交流方式。在污染环境这一特异生态环境中,降解基因的水平转移有着独特的功能与作用。研究环境中污染物降解基因在微生物间的水平转移,更深入地了解微生物种群适应污染环境的机理,对于评价污染物的环境毒理、生物可降解性以及污染环境的可修复潜力具有重要参考价值。在污染物生物修复实践中,可以通过调控降解基因的水平转移,增强污染环境中微生物的降解能力,更有效地发挥生物修复作用。文章将对环境中细菌间基因交流的机制,污染物降解基因的水平转移对微生物适应污染环境的机理、水平基因转移对代谢途径的进化及其对污染物生物修复作用的影响等方面的研究进展做一综述。

关键词：水平基因转移降解基因降解菌生物修复有机污染物

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污染土壤中有机磷农药降解菌的分离及其多样性

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生态学报 2005年第6期25卷 1502-1508页

作者：张瑞福吴旭平樊奔何健蒋建东李顺鹏南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

采用添加有机磷农药的选择性培养基,在长期受有机磷农药污染的土壤中分离到7株有机磷农药降解菌,经生理生化鉴定和系统发育分析,菌株mp-1鉴定为Pseudaminobactersp.,菌株mp-2为Alcaligenessp.,菌株mp-7为Brucellasp.,其他菌株为Ochrobac... 详细信息

采用添加有机磷农药的选择性培养基,在长期受有机磷农药污染的土壤中分离到7株有机磷农药降解菌,经生理生化鉴定和系统发育分析,菌株mp-1鉴定为Pseudaminobactersp.,菌株mp-2为Alcaligenessp.,菌株mp-7为Brucellasp.,其他菌株为Ochrobactrumsp.。16SrDNA序列同源性比较、系统发育分析和染色体ERIC-PCR指纹图谱扩增表明有机磷农药长期污染的土壤中有机磷农药降解菌具有丰富的多样性。

关键词：有机磷农药降解菌系统发育 ERIC-PCR指纹图谱多样性

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甲基对硫磷水解酶参与催化相关结构的研究

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生物工程学报 2005年第6期21卷 998-1002页

作者：吴旭平刘卫东曹慧李顺鹏崔中利南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

甲基对硫磷水解酶(MPH)是一种新的有机磷水解酶。将完整的甲基对硫磷水解酶基因(mpd)构建入pUC19载体,使得mpd基因以自身的启动子在EscherichiacoliDH5α中表达并得到了纯化。金属螯合实验发现MPH的活性不受金属螯合剂1,10菲啉的影响... 详细信息

甲基对硫磷水解酶(MPH)是一种新的有机磷水解酶。将完整的甲基对硫磷水解酶基因(mpd)构建入pUC19载体,使得mpd基因以自身的启动子在EscherichiacoliDH5α中表达并得到了纯化。金属螯合实验发现MPH的活性不受金属螯合剂1,10菲啉的影响;但用电感耦合等离子发射光谱测定其金属含量显示MPH是金属酶,1mol酶中结合了2mol的Zn2+。为确定参与MPH催化活性的必需氨基酸,用化学修饰剂碳化二亚胺、二乙基焦磷酸酯、磷酸吡哆醛和丁二酮处理MPH,然后检测其残余酶活力,结果表明天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸残基与酶的催化活性无关;而二乙基焦磷酸酯对组氨酸侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度的下降,其对酶活性的抑制率达到9.6h-1,说明组氨酸是酶活力所必需的基团。这些结果为进一步研究酶的结构及对酶进行分子改造提供了必要的基础数据。

关键词：甲基对硫磷水解酶金属离子含量化学修饰必需氨基酸

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DDT降解菌株DB-1的分离、系统发育及降解特性

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中国环境科学 2005年第6期25卷 674-677页

作者：张明星洪青何健许育新李顺鹏南京农业大学生命科学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室江苏南京210095

从农药厂下水道污泥中分离、筛选到1株能够在好氧条件下降解DDT的细菌菌株DB-1,根据表型特征、生理生化特性及16S rDNA序列的系统发育分析,将菌株DB-1初步鉴定为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp).该菌株能在含酵母膏(40mg/L)的DDT(40mg... 详细信息

从农药厂下水道污泥中分离、筛选到1株能够在好氧条件下降解DDT的细菌菌株DB-1,根据表型特征、生理生化特性及16S rDNA序列的系统发育分析,将菌株DB-1初步鉴定为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp).该菌株能在含酵母膏(40mg/L)的DDT(40mg/L)无机盐液体培养基中降解DDT,10d降解率达到83.6%,菌株DB-1在25～30℃长势较好,最适生长pH值为8.0.

关键词： DDT 农药残留生物降解系统发育分析

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杀螟硫磷降解菌FDS-1的分离鉴定及其降解特性

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中国环境科学 2005年第1期25卷 52-56页

作者：张忠辉洪青张国顺徐剑宏李顺鹏南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室江苏南京210095

从长期受杀螟硫磷污染的土壤中分离到一株能以杀螟硫磷为唯一碳源生长的细菌 FDS-1,根据其生理生化分析和 16S rDNA(GenBank Accession No. AY550913)序列同源性分析,将该菌初步鉴定为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.).该菌能在 14h... 详细信息

从长期受杀螟硫磷污染的土壤中分离到一株能以杀螟硫磷为唯一碳源生长的细菌 FDS-1,根据其生理生化分析和 16S rDNA(GenBank Accession No. AY550913)序列同源性分析,将该菌初步鉴定为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.).该菌能在 14h 内完全降解100mg/L 的杀螟硫磷.该菌降解杀螟硫磷最适 pH 值为 7.0,最适温度为 30℃,菌株降解杀螟硫磷的速率和起始接种量呈正相关.酶的定域试验表明,该菌中有机磷水解酶为胞内酶.

关键词：鉴定杀螟硫磷降解酶的定域

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植病生防芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定

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土壤 2005年第1期37卷 85-88页

作者：张晓舟徐剑宏李顺鹏南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

从山东和江苏采集的菜园土样中分离筛选得到4株芽孢杆菌B15、B110、B113和B122,它们均对植物病原真菌具有较强的拮抗能力且具有广谱性。4株芽孢杆菌可以致使黄瓜枯萎病原菌菌丝生长形态异常,出现菌丝前端膨大或变细、菌丝扭曲、分支加... 详细信息

从山东和江苏采集的菜园土样中分离筛选得到4株芽孢杆菌B15、B110、B113和B122,它们均对植物病原真菌具有较强的拮抗能力且具有广谱性。4株芽孢杆菌可以致使黄瓜枯萎病原菌菌丝生长形态异常,出现菌丝前端膨大或变细、菌丝扭曲、分支加剧、生成大量圆珠形囊状体和原生质凝聚等异常现象。通过对4个菌株培养物形态特征的观察和一系列的生理生化实验得到其初步鉴定结果,其中B15和B113为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis),B110为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),B122为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

关键词：拮抗作用芽孢杆菌筛选鉴定生物防治

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拟除虫菊酯类农药微生物降解研究进展

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土壤 2005年第6期37卷 577-580页

作者：王兆守李顺鹏南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

拟除虫菊酯类农药是杀虫剂中的第三大类,这类农药残留已成为目前农产品中的主要农药残留类型之一。而微生物在降解农药残留中具有重要的作用,微生物降解技术已成为去除农药残留的绿色生产技术。拟除虫菊酯类农药的微生物降解国内外已有... 详细信息

拟除虫菊酯类农药是杀虫剂中的第三大类,这类农药残留已成为目前农产品中的主要农药残留类型之一。而微生物在降解农药残留中具有重要的作用,微生物降解技术已成为去除农药残留的绿色生产技术。拟除虫菊酯类农药的微生物降解国内外已有的研究主要集中在降解现象,菌株的分离、鉴定及生理生化特性,酶学,不同光学异构体的降解、降解途径等方面,本文对此进行了较详细的回顾,并对将来的研究方向进行了展望。

关键词：拟除虫菊酯农药残留微生物降解光学异构体降解途径

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转座子标签法突变呋喃丹降解菌CFDS-1

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微生物学通报 2005年第2期32卷 34-38页

作者：徐剑宏洪青汪婷张小华李顺鹏南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

通过接合使供体大肠杆菌DH5α中的质粒pSC123上的转座子插入到受体菌CFDS1基因组DNA中,以引起该菌株的基因插入突变。利用转座子上的卡那霉素抗性基因和呋喃丹降解过程中红色物质的产生与否初步筛选出6株突变株,分别命名为CFDSM1～CFDSM... 详细信息

通过接合使供体大肠杆菌DH5α中的质粒pSC123上的转座子插入到受体菌CFDS1基因组DNA中,以引起该菌株的基因插入突变。利用转座子上的卡那霉素抗性基因和呋喃丹降解过程中红色物质的产生与否初步筛选出6株突变株,分别命名为CFDSM1～CFDSM6。紫外扫描和气谱检测结果进一步证明这些突变子确实失去了对呋喃丹的降解能力。根据转座子的序列设计引物,以6株突变株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,并对PCR产物进行限制性酶切分析,结果表明这些突变子中呋喃丹降解基因的失活就是由于转座子的插入而导致的。

关键词：呋喃丹转座子标签法降解突变

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