检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧与兽医 2025年第2期57卷 97-104页

作者：沈海潇李鑫杨德全葛菲菲王建黄士新姜平南京农业大学动物医学院/农业农村部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095 上海市动物疫病预防控制中心上海201400

旨在建立一种检测犬C群轮状病毒(CRV C)的探针法实时荧光反转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。以病毒基因组的保守序列VP6为靶标,设计合成1组LAMP引物探针,对反应的各项参数进行优化后确定方法的特异性、敏感性等各项指标,进行临床样品... 详细信息

旨在建立一种检测犬C群轮状病毒(CRV C)的探针法实时荧光反转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。以病毒基因组的保守序列VP6为靶标,设计合成1组LAMP引物探针,对反应的各项参数进行优化后确定方法的特异性、敏感性等各项指标,进行临床样品检测以评估方法的实际效果。结果:该方法检测下限为7.71×10^(0) copies/μL,敏感性与荧光定量RT-PCR相当。重复试验结果的变异系数小于4.35%。与犬A群轮状病毒(CRV A)、犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬肠道冠状病毒(CCoV)和犬星状病毒(CaAstV)均无交叉反应。临床样品检测符合率试验表明,本方法与荧光定量RT-PCR方法的总体符合率达到了98.46%(64/65)。综上,本研究建立的探针法实时荧光RTLAMP方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、仪器成本低等优点,可用于CRV C快速检测、临床诊断与疫病监测。

关键词：探针法环介导等温扩增犬C群轮状病毒快速检测

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猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融合和凋亡

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微生物学报 2003年第3期43卷 407-412页

作者：曾巧英陆承平南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室

猪链球菌 2型 (SS2 )溶菌酶释放蛋白 (MRP)的致病作用迄今不明 ,为此 ,以HEp 2细胞为上皮细胞体外模型 ,将纯化的MRP溶液和细胞共孵育 ,光镜观察 ,发现MRP可诱导细胞发生两种典型形态学变化 :一是诱导细胞融合形成多核巨细胞 ,随后巨细... 详细信息

猪链球菌 2型 (SS2 )溶菌酶释放蛋白 (MRP)的致病作用迄今不明 ,为此 ,以HEp 2细胞为上皮细胞体外模型 ,将纯化的MRP溶液和细胞共孵育 ,光镜观察 ,发现MRP可诱导细胞发生两种典型形态学变化 :一是诱导细胞融合形成多核巨细胞 ,随后巨细胞发生凋亡 ;二是诱导单个细胞凋亡。透射电镜观察和流式细胞分析确证MRP具有诱导上皮细胞凋亡的功能 ,凋亡率达 1 8%。证明MRP可单独作为SS2的毒力因子。

关键词：猪链球菌溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融合细胞凋亡

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串联表达PRRSV M与GP5蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

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生物工程学报 2006年第4期22卷 555-560页

作者：蒋文明姜平李玉峰汤景元王先炜杜以军南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

利用PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的M基因,按正确的读码框与GP5基因串联,成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-M-GP5,经PCR、测序鉴定正确。PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,产生重组腺病毒DNA。重组... 详细信息

利用PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的M基因,按正确的读码框与GP5基因串联,成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-M-GP5,经PCR、测序鉴定正确。PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,产生重组腺病毒DNA。重组腺病毒DNA经PacⅠ线性化后用脂质体转染HEK-293A细胞,在细胞内包装成完整的腺病毒,通过IFA可以检测到M与GP5串联的重组腺病毒构建成功,可以正确地表达目的蛋白。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,结果表明可以诱导产生较强的体液免疫应答(ELISA抗体和中和抗体)和细胞免疫应答(淋巴细胞增殖和CTL反应)。证明该重组腺病毒具有较好的免疫原性,为下一步猪体免疫试验奠定了基础。

关键词： PRRSV M GP5 重组腺病毒体液免疫细胞免疫

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PCV2 Rep基因启动子区vISRE突变株的生物学特性

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微生物学报 2009年第9期49卷 1217-1222页

作者：顾金燕曹瑞兵张羽陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

【目的】为了初步揭示PCV2Rep基因启动子区类干扰素刺激反应元件(vISRE)的生物学功能。【方法】应用感染性克隆技术构建了2株vISRE点突变的重组PCV2,对突变病毒在PK15细胞上的增殖特性、遗传稳定性及对干扰素刺激的反应特性进行了分析... 详细信息

【目的】为了初步揭示PCV2Rep基因启动子区类干扰素刺激反应元件(vISRE)的生物学功能。【方法】应用感染性克隆技术构建了2株vISRE点突变的重组PCV2,对突变病毒在PK15细胞上的增殖特性、遗传稳定性及对干扰素刺激的反应特性进行了分析。【结果】Rep基因启动子区vISRE点突变后PCV2仍可在PK15细胞中正常复制,但病毒滴度比亲本毒株下降。PCV21740G-C在PK15细胞上3至10代之间遗传稳定,PCV21741A-T在PK细胞上第3代病毒保持突变基因的特征,但传至第7代时1743和1744位的AC突变为TT,并一直保持到第10代。100U/mL的PoIFN-α处理感染病毒的PK15细胞后,亲本毒株和2个突变毒株的阳性感染细胞数量均有增加,但亲本毒株病毒粒子数的增加显著高于2个突变毒株。【结论】Rep基因启动子区vISRE的突变影响PCV2在PK15上的增殖和对干扰素刺激的反应,推测其可能在干扰素促进病毒增殖中发挥调控作用。

关键词：猪圆环病毒2型 Rep基因启动子干扰素刺激反应元件基因突变

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表达猪圆环病毒2型Cap和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5融合蛋白重组腺病毒的构建和免疫原性测定

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生物工程学报 2009年第11期25卷 1639-1645页

作者：王先炜李玉峰姜平南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

断奶后多系统衰弱综合征(PMWS)是目前规模化猪场常见的传染病,由PCV2感染引起。临床上PCV2与PRRSV混合感染较常见,死亡率和发病率很高,但目前尚无能有效预防该病的商品化疫苗。本研究利用基因克隆方法,构建融合表达PCV2-Cap蛋白与PRRSV-... 详细信息

断奶后多系统衰弱综合征(PMWS)是目前规模化猪场常见的传染病,由PCV2感染引起。临床上PCV2与PRRSV混合感染较常见,死亡率和发病率很高,但目前尚无能有效预防该病的商品化疫苗。本研究利用基因克隆方法,构建融合表达PCV2-Cap蛋白与PRRSV-GP5蛋白的重组腺病毒rAd-Cap-GP5,经IPMA、IFA和Western blotting验证了Cap蛋白和GP5蛋白在该重组病毒中获得表达。将该重组腺病毒免疫小鼠测定其抗体、中和抗体,结果显示小鼠免疫后出现两种病毒的抗体和中和抗体,诱导小鼠产生明显的体液免疫应答,可以作为预防PCV2-PRRSV混合感染的基因工程疫苗候选毒株,为PCV2和PRRSV二联重组亚单位疫苗的研究奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型猪繁殖与呼吸综合征病毒重组腺病毒免疫原性

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体内表达新基因trag在猪链球菌的分布及其免疫反应性分析

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微生物学报 2008年第12期48卷 1642-1648页

作者：祝昊丹顾宏伟陆承平南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

【目的】trag(transfer gene G)是利用IVIAT(in vivo induced antigen technology)通量筛选鉴定的猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)感染相关因子,研究该基因在猪链球菌(Streptococcus suis,SS)中的分布情况,研究康复血清与免疫血清在免疫印迹中的反应性有无,间接证明其在体内感染与体外培养时表达差异。【方法】鉴于我国分离株trag与GenBank公布的SS2北美株89/1591的trag序列有95.8%的同源性,据此设计和合成一对检测引物,对SS2我国江苏及四川流行株、其他临床分离株和参考株及SS1、SS1/2、SS9、SS7及C群猪源链球菌共43株进行PCR扩增。另设计一对引物,扩增5株SS代表菌株trag的完整阅读框,并对扩增产物进行测序。据软件分析后,选择TRAG(Transfer protein G)免疫原性良好的区域片段的核酸设计表达引物,PCR扩增后定向克隆至表达载体pET28a(+)构建表达质粒,表达蛋白转印到PVDF膜上,分别与SS2猪康复血清和猪高免血清反应。【结果】trag在SS2中94%(30/32)阳性,SS9中67%(4/6)阳性,SS7阳性,SS1、SS1/2及C群菌阴性。5株细菌TRAG的氨基酸序列与SS2中国株98HAH33、05ZYH33及北美株89/1591同源性>97%。所获得重组蛋白只能被康复血清识别。【结论】从SS致病株中检出感染相关基因trag,提示该基因可能与SS致病性有关,重组蛋白的免疫转印结果表明,TRAG可能与SS2体内感染相关。

关键词：猪链球菌2型 PCR检测 Transfer protein G(TRAG) 鉴定

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猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

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微生物学报 2006年第3期46卷 412-417页

作者：曹瑞兵周国栋周海霞包晶晶陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

为了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFN-β成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαA-PIB。pPICZαA-PIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。多株PCR鉴定为阳性的酵... 详细信息

为了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFN-β成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαA-PIB。pPICZαA-PIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。多株PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFN-β,其中B1株酵母的PoIFN-β产量最高,约为2.5×105U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×106U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIFN-β阳性抗血清发生特异反应。表达产物比PoIFN-β理论推导分子量(约20.8kDa)大,推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组PoIFN-β对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFN-β对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显。

关键词：猪β干扰素毕赤酵母分泌表达伪狂犬病毒抗病毒

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我国猪繁殖与呼吸综合征病毒NT0801分离株分子特征

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病毒学报 2011年第6期27卷 542-548页

作者：陆琪王兴龙宋艳华李玉峰白娟姜平南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前引起国内外养猪业严重经济损失的重要病原之一,病毒基因和毒力变异较大。PRRSV NT0801株分离自我国发病猪群,毒力较强,但NSP2基因不存在高致病性PRRSV 30个氨基酸的缺失。为了进一步阐明该分离株的... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前引起国内外养猪业严重经济损失的重要病原之一,病毒基因和毒力变异较大。PRRSV NT0801株分离自我国发病猪群,毒力较强,但NSP2基因不存在高致病性PRRSV 30个氨基酸的缺失。为了进一步阐明该分离株的分子特征,本研究对该毒株全基因序列进行了测定和分析,结果该毒株基因组全长15 439 bp,其中包含29 nt Poly(A)。与高致病性PRRSV毒株JXA1比较,核酸序列同源性为96.7%,推导的GP3和GP5氨基酸序列同源性分别为97.2%和98.5%,但NSP2基因无30个氨基酸的缺失;与传统型毒株ch-1a比较,推导的GP3和GP5氨基酸序列同源性分别为92.9%和91.5%;基因进化树分析结果显示其介于高致病性和传统PRRSV毒株之间。与其它不同毒力PRRSV分离株基因序列比较,未发现明显重组信号。不同毒力毒株氨基酸残基比对分析结果显示,15个位点潜在毒力相关氨基酸残基中,该毒株有9个与高致病性PRRSV毒株一致,3个与高致病性PRRSV毒株不同,但与传统型和JXA1疫苗株相同,1个位点只与JXA1疫苗株相同,2个与其它毒株都不相同。表明该分离株与高致病性PRRSV密切相关,PRRSV流行毒株变异与基因突变有关,从而为该病毒毒力基因定位研究奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征

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猪α1-干扰素的基因改造与高效原核表达

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生物工程学报 2004年第2期20卷 291-294页

作者：曹瑞兵徐学清周斌陈德胜陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

poIFN α1基因中含有大量的大肠杆菌稀有密码子 ,为了获得高表达 ,使用了大肠杆菌的偏爱密码子 ,人工合成了poIFN α1成熟蛋白编码基因。在保留编码蛋白序列的同时 ,使其 5′端A +T的含量增加到最大限度 ,并将其终止密码子改为TAA。将... 详细信息

poIFN α1基因中含有大量的大肠杆菌稀有密码子 ,为了获得高表达 ,使用了大肠杆菌的偏爱密码子 ,人工合成了poIFN α1成熟蛋白编码基因。在保留编码蛋白序列的同时 ,使其 5′端A +T的含量增加到最大限度 ,并将其终止密码子改为TAA。将合成的poIFN α1成熟蛋白编码基因插入原核单纯表达载体pRLC中 ,转化大肠杆菌DH5α。实现了poIFN α1在大肠杆菌中的高效表达 ,表达产物以包涵体形式存在。纯化的包涵体经含DTT的 6mol L盐酸胍的变性液溶解及含GSH GSSG的复性液复性处理 ,复性后的表达产物浓缩后经凝胶层析纯化 ,细胞病变抑制法测定表明 ,重组poIFN α1具有较高的抗病毒活性 ,约为 6 4x10 6 u mg。

关键词：猪 α1-干扰素基因原核表达 poIFN-α1 大肠杆菌包涵体抗病毒活性

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H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立

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微生物学报 2005年第1期45卷 58-61页

作者：郑其升张晓勇刘华雷李鹏陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

根据GenBank公布的H5N1亚型禽流感病毒 (AIV)血凝素 (HA)基因序列设计引物 ,用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA1基因 ,将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中 ,构建原核表达载体pET_HA1。阳性质粒转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱... 详细信息

根据GenBank公布的H5N1亚型禽流感病毒 (AIV)血凝素 (HA)基因序列设计引物 ,用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA1基因 ,将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中 ,构建原核表达载体pET_HA1。阳性质粒转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导 ,HA1基因获得表达 ,重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 ,确定了表达HA1基因的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 8mmol L ,诱导时间为 3h。Westernblot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5亚型AIV抗体的iHA_ELISA方法。结果表明 ,抗原的最佳包被浓度为 4 μg mL ,血清的最佳稀释度为 1∶2 0 0 ,阳性标准初步定为 :OD待检血清>0 5 ,且OD待检血清 OD阴性血清 >2。

关键词： H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因原核表达 iHA—ELISA

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