检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医学报 2011年第8期31卷 1095-1098页

作者：刘捷陆琪王先炜李玉峰王晓晔姜平南京农业大学兽医学院农业部动物疫病诊断与免疫重(点开放实验室) 江苏南京210095

本研究根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因和TTV2非编码区序列合成引物,利用PCR方法对2009年来自江苏、浙江、上海、广东和广西等5个省市76个患病猪群的仔猪病料进行了病原学检测。结果显示,PCV2阳性率64.5%(49/76)... 详细信息

本研究根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因和TTV2非编码区序列合成引物,利用PCR方法对2009年来自江苏、浙江、上海、广东和广西等5个省市76个患病猪群的仔猪病料进行了病原学检测。结果显示,PCV2阳性率64.5%(49/76),TTV2阳性率47.4%(36/76),PCMV阳性率69.7%(49/76)。在PCV2的阳性病料中,与PCMV和/或TTV2混合感染占93.9%(46/49),PCMV单独感染阳性率18.4%(14/76),表明该地区PCV2感染率明显提高,混合感染种类复杂,从而为有效预防和控制这些疾病提供了理论依据。

关键词：猪圆环病毒2型猪巨细胞病毒 TorqueTeno病毒流行病学

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副猪嗜血杆菌重组P2蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立

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中国兽医学报 2011年第4期31卷 480-484,520页

作者：李鹏姜平李军星曹珺张国龙李玉峰宋艳华王先炜南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095 长江大学动物科学学院湖北荆州434025

根据GenBank中副猪嗜血杆菌(HPS)的P2蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用P2-PCR方法从HB070214株中克隆了1 077bp的P2蛋白基因。将P2蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-P2,在IPTG的诱导下成功表达了相对... 详细信息

根据GenBank中副猪嗜血杆菌(HPS)的P2蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用P2-PCR方法从HB070214株中克隆了1 077bp的P2蛋白基因。将P2蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-P2,在IPTG的诱导下成功表达了相对分子质量约为60 500的可溶性融合蛋白P2-His;经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描分析,融合蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的30%。将融合蛋白加入镍琼脂糖凝胶树脂层析柱,经300mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱,其纯度可达92.5%。用Western blotting分析纯化后的融合蛋白,显示良好的生物学活性。利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件,建立了可检测抗HPS P2蛋白抗体的间接ELISA方法(P2-ELISA),并用所建立的P2-ELISA与国外进口的HPS检测试剂盒Synbiocits-ELISA对196份临床送检血清进行平行检测,阳性符合率为93.4%。结果表明,本试验建立的P2-ELISA与Synbiocits-ELISA具有同样高的特异性。

关键词： HPS P2蛋白原核表达 ELISA

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4种商品化试剂盒检测猪瘟病毒抗体的比较分析

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中国兽医杂志 2011年第9期47卷 40-42页

作者：庞然张小敏周斌何丹妮陈溥言南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒感染引起的猪的急性、热性、高度致死性传染病,是严重影响养猪业发展的主要疫病之一。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类l6种传染病之一,我国亦将其列为一类传染病,是发生最多、危害最大、流行最广的动物传染... 详细信息

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒感染引起的猪的急性、热性、高度致死性传染病,是严重影响养猪业发展的主要疫病之一。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类l6种传染病之一,我国亦将其列为一类传染病,是发生最多、危害最大、流行最广的动物传染病之一。

关键词：猪瘟病毒抗体试剂盒商品化动物传染病世界动物卫生组织检测病毒感染

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整合猪瘟病毒囊膜糖蛋白假型鼠白血病病毒微量中和试验的建立和初步应用

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畜牧兽医学报 2011年第11期42卷 1570-1576页

作者：周斌刘珂魏建超陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

将构建的真核表达载体pcDNA-E0、pcDNA-E2和pcDNA-E012分别与MuLV假型病毒构建体系的2种骨架载体pHIT60和pHIT111经磷酸钙瞬时共转染293T细胞,48h后收集假病毒上清,超速离心后用抗CSFV多抗通过Western blot分析发现只有E012蛋白能够在... 详细信息

将构建的真核表达载体pcDNA-E0、pcDNA-E2和pcDNA-E012分别与MuLV假型病毒构建体系的2种骨架载体pHIT60和pHIT111经磷酸钙瞬时共转染293T细胞,48h后收集假病毒上清,超速离心后用抗CSFV多抗通过Western blot分析发现只有E012蛋白能够在假病毒颗粒表面表达,说明E012能够整合到假型病毒粒子表面。将此假病毒(MuLV-E012)感染SK6、PK-15、ST、BHK21、Vero、COS7、293T和CEF等8种细胞,48h后检测发现只有在SK6、PK-15和ST等猪源细胞中标记基因LacZ能有效表达,表明所构建的假病毒具有感染性,只能感染猪源细胞,进一步证实了猪瘟病毒对猪的单一嗜性,并且感染性与NH4Cl浓度存在极显著的线性负相关性,结果表明猪瘟病毒进入宿主细胞的过程有pH依赖性。将假病毒MuLV-E012代替强毒Shimen株与标准阴性、阳性血清和倍比稀释的待检血清混合后感染PK-15细胞,建立了微量中和试验,与全病毒微量中和试验进行了比较,结果表明所建立的方法能够代替强毒进行血清中和试验,检测临床血清的猪瘟病毒抗体中和效价。

关键词：猪瘟病毒囊膜糖蛋白鼠白血病病毒假病毒感染性微量中和试验

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改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体

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生物工程学报 2011年第6期27卷 926-934页

作者：郑其升毕志香李梅清侯继波陈溥言国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 山东省畜牧兽医职业学院潍坊261061 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

为了构建改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体,利用Cre/LoxP DNA重组系统以及本实验室表达Cre酶的BHK-21细胞系(BHK-Cre),以大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Eco gpt)为筛选标记构建可删除筛选标记的双... 详细信息

为了构建改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体,利用Cre/LoxP DNA重组系统以及本实验室表达Cre酶的BHK-21细胞系(BHK-Cre),以大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Eco gpt)为筛选标记构建可删除筛选标记的双表达穿梭载体pLR-gpt。将Eco gpt基因以及调控其表达的启动子基因置于2个同向的LoxP位点之间,2个独立的多克隆位点位于2个LoxP位点之外,最终获得的重组病毒可以在BHK-Cre细胞系上删除筛选标记Eco gpt。为了验证系统的有效性,将PRRSV NJ-a株ORF5与ORF6基因分别克隆入pLR-gpt的2个多克隆位点中,构建重组转移载体pLRgpt-ORF5/ORF6。经脂质体介导,将pLRgpt-ORF5/ORF6转染已感染亲本MVA 2 h的BHK-21细胞单层,用药物选择性培养基(MXHAT)在24孔板上进行连续筛选纯化,得到带有筛选标记的重组病毒rMVAgpt-GP5/M。将rMVAgpt-GP5/M感染BHK-Cre,获得删除筛选标记的重组病毒rMVA-GP5/M,Western blotting与间接免疫荧光证明重组病毒能表达GP5与M蛋白,经PCR和病毒生长曲线鉴定,获得删除筛选标记的重组病毒rMVA-GP5/M已经完全删除筛选标记gpt。结果表明成功构建了痘苗病毒表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体,并且外源基因的插入不影响亲本病毒的复制与外源基因的表达,具有较好的稳定性。

关键词： Cre/LoxP MVA表达系统猪繁殖与呼吸综合征病毒无标记重组病毒

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猪肺炎支原体P36基因在毕赤酵母中的表达

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江苏农业学报 2011年第2期27卷 307-312页

作者：祝永琴刘茂军冯志新魏建超曹瑞兵周斌陈溥言邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095

根据GenBank中猪肺炎支原体P36基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体特异性蛋白基因P36,克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-P36。PICZα-A-P36经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌... 详细信息

根据GenBank中猪肺炎支原体P36基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体特异性蛋白基因P36,克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-P36。PICZα-A-P36经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌P36蛋白于发酵上清液中,通过SDS-PAGE电泳以及Western-blotting进行鉴定,结果表明,P36蛋白基因获得了分泌性表达,而且具有良好的反应原性,这为猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制奠定了基础。

关键词：猪肺炎支原体 P36基因毕赤酵母分泌表达

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2008-2010年中国华东地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析

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中国农业科学 2011年第18期44卷 3886-3894页

作者：王小敏何孔旺张文文陈蔚茅爱华俞正玉温立斌倪艳秀张雪寒吕立新郭容利周俊明李彬江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院

【目的】对来自2008-2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场送检的病料进行PRRSV检测,并对其ORF5基因进行测序,确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。【方... 详细信息

【目的】对来自2008-2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场送检的病料进行PRRSV检测,并对其ORF5基因进行测序,确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。【方法】利用RT-PCR方法对采集的样品进行PRRSV检测,并对PRRSV检测呈阳性的36份病料进行ORF5基因的序列测定和分析。【结果】260份病料中共检测到118份PRRSV阳性样品,阳性率为45.4%。ORF5序列分析和系统进化树分析结果表明,本试验所获得的36株PRRSV毒株序列均属于北美型,与GenBank中高致病性PRRSV(HP-PRRSV)参考毒株的氨基酸同源性为94.6%-100%,并可分为5个亚群,亚群III与HP-PRRSV同源性最高,几乎所有的亚群中和表位(primary neutralizing epitope,PNE)都存在变异,亚群III和IV相对于其它亚群具有更多的糖基化位点。由于36个毒株是于2008-2010年间采集自安徽、江苏、上海等7省,进化树分析结果表明,病毒的分型并没有呈现明显的地域性。【结论】2008-2010年间中国华东地区普遍存在PRRSV感染,PRRSV流行株为HP-PRRSV,其遗传演化相对稳定,但也具有不同的遗传特征。来源于不同省市的PRRSV毒株的遗传关系存在交叉,虽然亚群IV和V只出现在部分省市,但PRRSV的分布没有呈现明显的地域特征。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS) 华东地区 ORF5基因遗传变异

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实时荧光定量PCR技术及在猪重大疫病中的诊断应用

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猪业科学 2011年第8期28卷 40-44页

作者：周斌南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095

实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术具有操作简便、特异性强、... 详细信息

实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术具有操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、快速高效、全封闭反应、高通量等特点。随着现代医学和分子生物学的飞速发展,该技术已在兽医诊断研究及临床应用方面发挥着越来越大的作用。文章对FQ-PCR的原理、分类以及在猪重大疫病的诊断应用进行了综述。

关键词：实时荧光定量PCR 猪重大疫病诊断

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猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的...

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第五届(秋季)南京农业大学畜牧兽医学术年会猪业峰会——规模猪场疫病综合防控研讨会

作者：王克伟李玉峰王先炜马涛张国龙姜平南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京 210095

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列，设计合成了1对特异性引物，参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物，经过PCR反应条件的优化，建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV... 详细信息

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列，设计合成了1对特异性引物，参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物，经过PCR反应条件的优化，建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4ng和7×10-4ng，对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测，结果PRRSV有55份阳性，BVDV有14份阳性，PRRSV和BVDV混合感染的有12份，与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR体系性能分析

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PK-15细胞膜蛋白提取方法的比较及猪瘟病毒膜表面受体的初步鉴定

PK-15细胞膜蛋白提取方法的比较及猪瘟病毒膜表面受体的初步鉴定

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第五届(秋季)南京农业大学畜牧兽医学术年会猪业峰会——规模猪场疫病综合防控研讨会

作者：周斌刘晓东王凤鹃刘珂陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京 210095

以猪肾细胞(PK-15)为材料，比较真核细胞膜蛋白提取试剂盒、超声破碎法、反复冻融法、低渗裂解法4种不同方法对PK-15细胞膜蛋白提取的影响，结果表明，通过超声破碎的膜制备方法提取的PK-15细胞膜蛋白较理想。用此方法提取PK-15细胞膜... 详细信息

以猪肾细胞(PK-15)为材料，比较真核细胞膜蛋白提取试剂盒、超声破碎法、反复冻融法、低渗裂解法4种不同方法对PK-15细胞膜蛋白提取的影响，结果表明，通过超声破碎的膜制备方法提取的PK-15细胞膜蛋白较理想。用此方法提取PK-15细胞膜蛋白，经SDS-PAGE后转印NC膜，利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)鉴定CSFV病毒的细胞受体。结果发现，PK-15细胞膜上有3种能与CSFV结合的蛋白质，分子量在90～100ku之间，暗示这些蛋白可能是CSFV受体或者受体复合物。

关键词：猪瘟病毒猪肾细胞膜蛋白超声破碎法表面受体

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