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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：毕振威王永山范红结王智群吴晓悠马金荣欧阳伟张海彬江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京 210014 南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095 江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京 210014 南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095

为分析当地非典型犬瘟热病毒(cDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性，根据已发表cDv的N基因序列设计引物，用RT-PcR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因，进行克隆和序列分析，结果表明：该非典型CDV的N基... 详细信息

为分析当地非典型犬瘟热病毒(cDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性，根据已发表cDv的N基因序列设计引物，用RT-PcR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因，进行克隆和序列分析，结果表明：该非典型CDV的N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96．6％～99．2％和97．9％～99．4％之间，与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93．2％～93．6％和96．4％～97．5％之间;在N基因系统发育进化树上，非典型CDV与12个强毒株处在同一亚群，而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。N基因在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62 ku，主要以包涵体的形式存在;用western blot分析，重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应;以纯化的重组N蛋白为抗原建立的CDV抗体间接EUSA检测方法具有良好的特异性。

关键词：非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析原核表达大肠杆菌

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猪感染类猪圆环病毒因子P1后血小板的变化

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内蒙古农业科技 2009年第3期37卷 54-56页

作者：温立斌何孔旺杨汉春吕立新郭容利周俊明钟书霖江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210014 国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 中国农业大学动物医学院北京100094 农业部预防兽医学重点开放实验室北京100094

探讨类猪圆环病毒因子P1感染对广西巴马小型猪血小板参数的影响。将12头30日龄的广西巴马小型猪随机、平均分成两组,实验组经腹股沟淋巴结途径接种类猪圆环病毒因子P1的分子克隆。采用自动血液分析仪检测接种后3d、8d、17d、24d、31d及... 详细信息

探讨类猪圆环病毒因子P1感染对广西巴马小型猪血小板参数的影响。将12头30日龄的广西巴马小型猪随机、平均分成两组,实验组经腹股沟淋巴结途径接种类猪圆环病毒因子P1的分子克隆。采用自动血液分析仪检测接种后3d、8d、17d、24d、31d及40d猪的外周血血小板参数。统计分析显示猪感染P1后,与对照组相比,实验组的血小板平均体积(MPV)无显著差异,而血小板计数(PLT)和血小板压积(PCT)在接种后8d明显降低,血小板体积分布宽度(PDW)在接种后17d显著降低。

关键词：类猪圆环病毒因子广西巴马小型猪血小板参敷

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类猪圆环病毒因子P1感染对猪红细胞的影响

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内蒙古农业科技 2009年第2期37卷 46-48页

作者：温立斌何孔旺杨汉春倪艳秀张雪寒俞正玉茅爱华江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210014 国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 中国农业大学动物医学院北京100094 农业部预防兽医学重点开放实验室北京100094

探讨类猪圆环病毒因子P1感染后,广西巴马小型猪发生贫血的类型,推断贫血发生的原因。12头30日龄的猪随机分成两组,每组6头,试验组经腹股沟淋巴结途径接种P1分子克隆。采用自动血液分析仪对接种后3d、8d、17d、24d、31d及40d猪的外周血... 详细信息

探讨类猪圆环病毒因子P1感染后,广西巴马小型猪发生贫血的类型,推断贫血发生的原因。12头30日龄的猪随机分成两组,每组6头,试验组经腹股沟淋巴结途径接种P1分子克隆。采用自动血液分析仪对接种后3d、8d、17d、24d、31d及40d猪的外周血进行红细胞各参数检测。统计分析结果显示P1感染后,与对照组相比,红细胞参数之间无差异的指标有RBC、HGB、HCT、MCV和MCHC等5项,而MCH在接种后17d明显降低,而RDW在31d增高明显。可见,猪感染类猪圆环病毒因子P1可导致小细胞低血色素性贫血。

关键词：类猪圆环病毒因子广西巴马小型猪贫血红细胞参数

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大肠杆菌O157∶H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

大肠杆菌O157∶H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病学术研讨会

作者：刘洁夏兴霞王永山张雪寒费荣梅何孔旺江苏省农业科学院兽医研究所／农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心南京 210014 南京农业大学动物医学院南京 210095 江苏省农业科学院兽医研究所／农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心南京 210014

用颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG，制备金标探针，喷涂于玻璃纤维膜上;将大肠杆菌O157∶H7抗原和抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体F1分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，组装成鼠血清O157∶H7抗体胶体金免疫层析检... 详细信息

用颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG，制备金标探针，喷涂于玻璃纤维膜上;将大肠杆菌O157∶H7抗原和抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体F1分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，组装成鼠血清O157∶H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条。实验结果：该试纸条仅与O157∶H7阳性鼠血清发生特异性反应;用该试纸条与常规间接ELISA平行比较检测O157∶H7免疫鼠血清，抗体效价分别为106和105，两者的敏感度相当。该试纸条操作简便，10 min可出结果，适用于调查与追溯鼠O157∶H7感染状况时的现场检测。

关键词：肠出血性大肠杆菌 O157∶H7 胶体金免疫层析试纸条动物模型

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动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病学术研讨会

作者：夏兴霞刘洁王永山诸玉梅欧阳伟何孔旺张雪寒江苏省农业科学院兽医研究所／农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心南京 210014 江苏省农业科学院兽医研究所／农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心南京 210014 南京农业大学动物医学院南京 210095

将*** O157∶H7(EHEC-O157∶H7)用甲醛灭活超声破碎，免疫BALB/c小鼠，制备免疫脾细胞;与SP/20骨髓瘤细胞融合后，获得七株分泌抗*** O157∶H7单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株，分别命名为2E7、B8、E7、D3、H7、F1和C3，Ig亚类分别是IgG... 详细信息

将*** O157∶H7(EHEC-O157∶H7)用甲醛灭活超声破碎，免疫BALB/c小鼠，制备免疫脾细胞;与SP/20骨髓瘤细胞融合后，获得七株分泌抗*** O157∶H7单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株，分别命名为2E7、B8、E7、D3、H7、F1和C3，Ig亚类分别是IgG2bK、***、IgMK，IgMK，IgMK和IgG2aK。用间接ELISA检测，E7和F1细胞培养上清液的效价为1.6×10 3，腹水效价均为1×1011;C3、2E7、B8、D3和H7细胞培养上清液的效价为1×101～2×102，腹水效价均为4×102～2.5×106。相加ELISA结果显示，D3和H7 mAbs对应相同的抗原表位，而其它五株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性，2E7、H7和D3为抗EHEC-O157∶H7特异性单克隆抗体，其它四株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Western blotting表明，C3、E7和F1三株mAbs在蛋白分子量28kD处有特异性条带，2E7、D3和H7三株mAbs在蛋白分子量35kD处有特异性条带，而mAbs B8则未显示蛋白带。

关键词：肠出血性大肠杆菌 O157 H7 单克隆抗体生物制剂人兽共患病

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动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ.分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ.分泌抗大肠杆菌O...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：夏兴霞刘洁王永山诸玉梅欧阳伟何孔旺张雪寒江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京 210014 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京 210014 南京农业大学动物医学院江苏南京 210095

将*** O157：H7(EHEC-O157：H7)用甲醛灭活、超声破碎，免疫BALB/c小鼠，制备免疫脾细胞：与SP/20骨髓瘤细胞融合后，获得七株分泌抗*** O157：H7单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株，分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3，Ig亚类分别是... 详细信息

将*** O157：H7(EHEC-O157：H7)用甲醛灭活、超声破碎，免疫BALB/c小鼠，制备免疫脾细胞：与SP/20骨髓瘤细胞融合后，获得七株分泌抗*** O157：H7单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株，分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3，Ig亚类分别是IgG2aκ、IgG2aκ、IgG1κ，IgMκ、IgMλ.、IgMκ和lgG2aκ。用间接ELISA检测，E7和F1细胞培养上清液的效价为1.6×10(3)，腹水效价均为1×10(11);C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10(1)％～2×10(2)，腹水效价均为1×10(3)。相加ELISA结果显示，F1、G9和G11三株mAbs对应相同的抗原表位，而其它4株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性，七株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Western blotting表明，C3、E7和F1三株mAbs在蛋白分子量28kD处有特异性条带，而其它四株mAbs则未显示蛋白带。

关键词：肠出血性大肠杆菌单克隆抗体生物制剂病原菌检测人畜共患病

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传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：欧阳伟王永山周宇张海彬唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

将引起传染性法氏囊病IBD免疫预防失败的IBD病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-... 详细信息

将引起传染性法氏囊病IBD免疫预防失败的IBD病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-VP2。对重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用IBDV抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应,抗原效价达到1.6×10～3;用western blot分析,在53 ku处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组Vp2蛋白能够自组装成病毒样颗粒,在感染细胞中发现了"包涵体样"结构。用HisTrap HP亲和层析柱纯化的重组Vp2蛋白作为包被抗原,建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。用重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞裂解物,免疫2周龄SPF鸡,一次免疫14 d后,ELISA检测抗体效价为8×10～2,中和抗体效价为1106,攻毒实验的存活率为30%;二次免疫14 d后,ELISA抗体效价为3.2×10～3,中和抗体效价为2536,存活率为100%。在实验观察7 d内,重组Vp2蛋白免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化,法氏囊/体重比高于对照组(p<0.05)。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和检测试剂方面显示出了应用前景。

关键词：传染性法氏囊病病毒 Vp2基因病毒样颗粒包涵体样结构间接ELISA 免疫实验

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近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达

近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：曹冰玉王永山范红结欧阳伟王忠灿唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

为制备近期IBDV毒株的重组VP2蛋白,将近期安徽IBD免疫预防失败的病鸡法氏囊组织中扩增的VP2基因定向克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-VP2,转化大肠杆菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后,用IBDV双抗体夹心ELISA检测,呈阳... 详细信息

为制备近期IBDV毒株的重组VP2蛋白,将近期安徽IBD免疫预防失败的病鸡法氏囊组织中扩增的VP2基因定向克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-VP2,转化大肠杆菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后,用IBDV双抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应;以SDS-PAGE分析,重组VP2融合蛋白的分子量为68ku,表达量约占菌体总蛋白的16.0%,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体内;在Western-blotting中,重组VP2蛋白与IBDV抗体反应形成1条特异性蛋白带。本实验为研制针对近期流行IBDV毒株的新型基因工程疫苗和检测试剂奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 IBDV VP2 原核表达

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传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

传染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆虫细胞中的表达与应用

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：欧阳伟王永山周宇张海彬唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

将近期引起IBD免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-... 详细信息

将近期引起IBD免疫预防失败的传染性法氏囊病病毒(IBDV)vp2基因,定向克隆入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-VP2,转化Escherichia coli DH10Bac感受态,筛选重组杆状病毒表达质粒pBac-VP2。用pBac-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-VP2。对重组杆状病毒vBac-VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用IBDV抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应,抗原效价达到1.6×103;用Western blotting分析,在53kDa处出现一条特异蛋白条带;电镜观察,重组Vp2蛋白能够自组装成病毒样颗粒,在感染细胞中发现了"包涵体样"结构。用HisTrap HP亲和层析柱纯化的重组Vp2蛋白作为包被抗原,建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。用重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞裂解物,免疫2周龄SPF鸡,一次免疫14d后,ELISA检测抗体效价为8×102,中和抗体效价为1106,攻毒实验的存活率为30%;二次免疫14d后,ELISA抗体效价为3.2×103,中和抗体效价为2536,存活率为100%。在实验观察7d内,重组Vp2蛋白免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化,法氏囊/体重比高于对照组(P<0.05)。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和检测试剂方面显示出了应用前景。

关键词：传染性法氏囊病病毒 Vp2基因病毒样颗粒包涵体样结构间接ELISA 免疫实验

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IBDV抗原表位与VP2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达

IBDV抗原表位与VP2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：周宇王永山范红结欧阳伟唐雨德王忠灿江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所

运用PCR重叠延伸技术将传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位5e与VP2基因连接构建组合基因VP2-5e,将其插入到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHT中,转化*** DH10Bac感受态细胞,经三抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBacHT-VP2-5e,用脂质体... 详细信息

运用PCR重叠延伸技术将传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位5e与VP2基因连接构建组合基因VP2-5e,将其插入到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHT中,转化*** DH10Bac感受态细胞,经三抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBacHT-VP2-5e,用脂质体法转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒vBacHT-VP2-5e。对vBacHT-VP2-5e感染的Sf9细胞,以间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;电镜检查,重组VP2-5e蛋白能够自组装成病毒样颗粒(VLP);用免疫印迹分析(Western-blotting),在59kD处出现一条特异性蛋白条带。本实验为组合基因型重组IBD多价疫苗的研究奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP2基因抗原表位组合基因表达

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