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中国血吸虫病防治杂志 2015年第2期27卷 139-145页

作者：马茜茜洪炀韩宏晓陆看马帅王涛刘艳涛韩倩傅志强陆珂李浩李祥瑞林矫矫南京农业大学动物医学院南京210095 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

目的了解日本血吸虫促凋亡基因Sj BAD的生物学、免疫学和转录表达特征,评估Sj BAD重组蛋白作为日本血吸虫病疫苗候选分子的潜力。方法根据Sj BAD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增Sj BAD基因,构建重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD。采... 详细信息

目的了解日本血吸虫促凋亡基因Sj BAD的生物学、免疫学和转录表达特征,评估Sj BAD重组蛋白作为日本血吸虫病疫苗候选分子的潜力。方法根据Sj BAD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增Sj BAD基因,构建重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD。采用实时定量PCR检测Sj BAD基因在日本血吸虫不同发育期及42 d雌、雄虫体内的转录水平;应用Western blotting和间接ELISA法分析Sj BAD重组蛋白的抗原性和免疫原性。用重组抗原Sj BAD免疫BALB/c小鼠,通过计算减虫率及肝脏减卵率,评估重组抗原作为血吸虫病候选疫苗分子的潜力。结果成功克隆了日本血吸虫Sj BAD基因,构建了重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD,并在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白分子量约为22 k Da。Western blotting表明Sj BAD具有较好的抗原性和免疫原性,间接ELISA法检测表明重组蛋白免疫小鼠产生了高水平的特异性抗体Ig G。实时定量PCR检测发现Sj BAD基因在日本血吸虫的各个发育阶段均有转录,以14 d表达量最高,且在雄虫体内的表达量高于雌虫。两次动物免疫试验表明,重组蛋白Sj BAD在BALB/c小鼠体内诱导了30.82%和27.87%的减虫率,及42.52%和45.84%的肝脏虫卵减少率,均显著高于PBS对照组(P均<0.05)。结论成功克隆、表达了日本血吸虫促凋亡相关基因Sj BAD,该基因在日本血吸虫不同发育期虫体内均有表达。纯化的重组Sj BAD蛋白在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果。

关键词：日本血吸虫细胞凋亡 BAD

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日本血吸虫促凋亡基因SjBAD真核表达及其功能研究

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畜牧与兽医 2015年第11期47卷 70-75页

作者：马茜茜洪炀韩宏晓陆看马帅王涛刘艳涛韩倩傅志强陆珂李浩李祥瑞林矫矫南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室上海200241 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

根据日本血吸虫促凋亡基因SjB AD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增SjB AD,选用pcD NA3.1(+)真核表达载体,构建pcDNA3.1(+)-SjB AD,并将其转染到293T细胞内,采用实时定量PCR检测SjB AD在转染入293T细胞培养不同时期后的转录水平;利用... 详细信息

根据日本血吸虫促凋亡基因SjB AD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增SjB AD,选用pcD NA3.1(+)真核表达载体,构建pcDNA3.1(+)-SjB AD,并将其转染到293T细胞内,采用实时定量PCR检测SjB AD在转染入293T细胞培养不同时期后的转录水平;利用细胞流式术检测pcD NA3.1(+)-SjB AD转染入293T细胞后细胞的凋亡水平。结果:成功克隆、表达了日本血吸虫SjB AD基因,构建了真核重组表达质粒pcD NA3.1(+)-SjB AD,并将其转染入293T细胞内,利用实时定量PCR检测SjB AD在转染入293T细胞培养36h后转录水平最高。利用细胞流式术检测pcD NA3.1(+)-SjB AD转染入293T细胞后可以引起细胞凋亡。本文为研究线粒体细胞凋亡通路和血吸虫的生长发育奠定基础。

关键词：日本血吸虫真核细胞凋亡 BAD

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猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用

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中国兽医科学 2014年第10期44卷 1022-1028页

作者：翟淑燕陈兴慧白娟王先炜姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价... 详细信息

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白中和活性单克隆抗体夹心ELISA

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猪流行性腹泻在亚洲流行的时空进化分析

猪流行性腹泻在亚洲流行的时空进化分析

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第五届中国兽药大会(中国畜牧兽医学会动物药品学分会2014年学术年会、中国畜牧兽医学会生物制药学分会暨中国微生物学会兽医微生物学专业委员会联合学术论坛)

作者：孙敏马家乐汪鸣宋文超张炜姚火春南京农业大学动物医学院江苏南京2100952 农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095 南京农业大学动物医学院江苏南京2100952

猪流行性腹泻( porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征的猪肠道疾病,给亚洲养猪业造成了严重的经济损失.本研究测定了2011-2014年间的11株... 详细信息

猪流行性腹泻( porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征的猪肠道疾病,给亚洲养猪业造成了严重的经济损失.本研究测定了2011-2014年间的11株PEDV全基因组序列,并与NCBI已公布的其他38株PEDV全序列进行遗传进化分析,并根据219个亚洲毒株的S基因序列探索PEDV在亚洲流行的时空性.结果显示,11株PEDV基因组全长均为28038nt(不包含PolyA),相互间同源性在97.5％至99.7％,且总计存在2373个点突变.49株PEDV的序列变异分析发现全基因组中存在4个高突变区域,分别命名为V1,V2,V3及V4.其中Vl位于nsp2及nsp3之间,V2位于S基因的氨基端,V3位于S基因的羧基端及ORF3之间,而V4位于N基因中,其中S基因突变率最高.全基因组的系统进化树表明PEDV毒株可以分为两个大群:流行群(PX)及经典群(CX).流行群均来自2008年后分离的中国及美国株;而中韩两国2008年前的分离株及欧洲经典株CV777均包含于经典群,暗示PEDV毒株2008年前后发生重大变异而提高其扩散效率及致病力.区分流行群(PX)及经典群(CX)毒株的差异主要位于S基因的氨基端1-1179bp(NTD).同时根据S基因全长及NTD序列同样可以将49株PEDV分为经典群及流行群,暗示S基因可以代替基因组研究PEDV毒株之间的遗传区分.219个背景清楚的S基因的系统进化树亦分为明显的流行群(PX)分支和经典群(CX)分支,同时又各自分为若干亚群:PXla,lb,lc,2a 2b,2c及CXla,lb,lc.中国的流行情况最复杂,包括了PX2b及PX 2c以外所有亚型,其中PXla是主要流行亚群;韩国次之,包含了PXlb、PX2b、PX2c及CXlc四个亚群,目前PXlb是主要流行亚群.另外PXla,PXlc,CXla及CXlb仅在中国流行,而PX2c只在韩国流行,表明PEDV的流行亚型存在一定的地域性;另外,CXlc亚群最为复杂,可能是PEDV重组变异的起点.从219个样本的地理分布分析,中国的疫情已扩散至整个东南部,甚至蔓延至四川、东北等,韩国同样面临这个问题,而泰国及台湾疫情也逐渐蔓延.根据219株S基因的背景信息及遗传特点,重建了PEDV在亚洲流行的时空性.截止至2005年,PEDV流行以经典群毒株为主;而至2010年,流行群毒株率先在韩国、泰国及日本逐步爆发流行,而中国直到2011年才有流行群毒株的报道,并突然大范围频繁爆发,持续至今.目前,引起亚洲各国PEDV持续爆发的毒株主要来自流行群.通过重建了PEDV在亚洲流行的时空性,初步说明PEDV不断地由经典群向流行群进化,疫情不断蔓延且流行亚群逐渐复杂,而S基因特别是氨基端l-1179bp基因发挥了关键作用.

关键词：猪流行性腹泻病毒全基因组分析流行群及经典群遗传地理学区分时空进化分析亚洲

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饲料中氟腺呤含量HPLC检测方法的建立

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畜牧与兽医 2014年第6期46卷 23-26页

作者：吴昊张丽芳肖文龙张可煜薛飞群严明江善祥南京农业大学动物医学院兽医药理与毒理实验室江苏南京210095 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫病学重点实验室中国农业科学院兽药安全评价及兽药残留重点开放实验室上海200241

建立了检测饲料中氟腺呤含量的高效液相色潽法。饲料中氟腺呤经甲醇提取,液液分配净化后,以40%乙腈溶液为流动相,在C18色谱柱上,紫外检测器（波长261 nm）下分离检测。方法的检测限为0.007 2 mg/mL,定量限为0.018 mg/mL。该方法线性关... 详细信息

建立了检测饲料中氟腺呤含量的高效液相色潽法。饲料中氟腺呤经甲醇提取,液液分配净化后,以40%乙腈溶液为流动相,在C18色谱柱上,紫外检测器（波长261 nm）下分离检测。方法的检测限为0.007 2 mg/mL,定量限为0.018 mg/mL。该方法线性关系良好,在添加浓度范围内,氟腺呤的平均回收率为85.7%-99.2%,相对标准偏差为1.9%-3.8%。经验证该方法快速简便,准确性和重现性良好。

关键词：高效液相色谱饲料氟腺呤检测

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猪巨细胞病毒gB基因的原核表达与间接ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2013年第1期35卷 40-43页

作者：朱月华刘捷白娟宋艳华王先炜姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

猪巨细胞病毒(PCMV)是引起新生仔猪死亡、鼻炎、肺炎和生长速度减缓的重要病原之一,我国尚无有效的诊断方法。为建立检测PCMV的ELISA方法,本研究以重组PCMV囊膜糖蛋白B(gB蛋白)为包被抗原,优化反应条件:抗原包被量0.4μg/mL,待检血清稀... 详细信息

猪巨细胞病毒(PCMV)是引起新生仔猪死亡、鼻炎、肺炎和生长速度减缓的重要病原之一,我国尚无有效的诊断方法。为建立检测PCMV的ELISA方法,本研究以重组PCMV囊膜糖蛋白B(gB蛋白)为包被抗原,优化反应条件:抗原包被量0.4μg/mL,待检血清稀释度1∶100,37℃包被2 h后4℃过夜,5%脱脂乳37℃封闭2 h,二抗1∶10 000稀释,37℃作用2 h,抗体临界值为S/P≥0.354判为阳性,S/P≤0.295判为阴性,介于二者之间为可疑,建立了PCMV抗体间接ELISA检测方法。与猪瘟、猪伪狂犬病、猪附红细胞体病、副猪嗜血杆菌及猪圆环病毒2型等血清抗体无交叉反应,批间和批内重复性较好,对江苏省259份仔猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,从而为PCMV检测和流行病学调查提供了有效方法。

关键词：猪巨细胞病毒重组囊膜糖蛋白B 原核表达间接ELISA

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猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测与ORF3基因分子流行病学调查

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中国预防兽医学报 2013年第7期35卷 555-558,561页

作者：董彦鹏白娟范宝超李玉峰姜平南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为调查乳仔猪腹泻引起疫情的病原,本研究自2011年2月至2012年3月收集华东地区47个规模猪场共153份腹泻病料样品,采用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV),并进行ORF3基因序列分析。结果显示:26个猪场的88份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到5... 详细信息

为调查乳仔猪腹泻引起疫情的病原,本研究自2011年2月至2012年3月收集华东地区47个规模猪场共153份腹泻病料样品,采用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV),并进行ORF3基因序列分析。结果显示:26个猪场的88份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到55.32%,病料阳性率达到57.52%。ORF3基因测序分析显示:11个流行病毒株ORF3全基因序列大小均为675 bp,编码224个氨基酸。11个流行株ORF3基因同源性为95.9%～99.9%,编码氨基酸同源性为96.4%～100%。与欧洲代表性强毒株CV777基因同源性为96.3%～97.0%,编码氨基酸同源性为95.1%～96.4%,与CV777弱毒疫苗株基因同源性为96.8%～97.6%,编码氨基酸同源性为92.3%～93.4%,并且无疫苗病毒株ORF3基因的49个碱基缺失。与韩国病毒株比较,其基因同源性为95.0%～98.5%,编码氨基酸同源性为95.5%～99.6%。基因遗传进化树分析表明,国内外PEDV株可分为4群。我国主要流行病毒株属于第1群,与韩国病毒株亲缘关系较近,而与我国疫苗病毒株存在较大差异。该研究表明,PEDV可能是目前我国仔猪腹泻的主要病原之一,我国PEDV流行病毒株存在明显基因变异。

关键词：猪流行性腹泻病毒 RT-PCR ORF3 流行病学

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禽致病性大肠杆菌毒力基因F11分布的检测及其表达

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中国兽医科学 2013年第10期43卷 1011-1015页

作者：孟庆美王少辉任建鸾诸葛祥凯陆承平戴建君南京农业大学动物医学院农业部动物细菌病重点实验室江苏南京210095 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为研究禽致病性大肠杆菌F11毒力基因的功能,根据禽致病性大肠杆菌IMT5155毒力基因F11的序列,设计合成特异性引物,通过PCR方法检测了毒力基因F11在禽致病性大肠杆菌中的分布,并以IMT5155基因组DNA为模板扩增F11基因片段,将其定向克隆到pE... 详细信息

为研究禽致病性大肠杆菌F11毒力基因的功能,根据禽致病性大肠杆菌IMT5155毒力基因F11的序列,设计合成特异性引物,通过PCR方法检测了毒力基因F11在禽致病性大肠杆菌中的分布,并以IMT5155基因组DNA为模板扩增F11基因片段,将其定向克隆到pET-28a(+)载体中构建原核表达质粒pET-28a-F11,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,纯化表达产物,制备免疫血清进行黏附抑制试验。结果显示,F11基因在禽致病性大肠杆菌中的分布率为22.2%(10/45),主要分布于大肠杆菌B2进化群中。利用F11免疫血清进行的Western-blot分析表明,F11可以在实验室培养条件下正常表达。黏附抑制试验显示,F11免疫血清可以抑制禽致病性大肠杆菌IMT5155对宿主细胞的黏附,表明F11可能在禽致病性大肠杆菌感染过程中发挥作用。

关键词：禽致病性大肠杆菌毒力基因F11 黏附抑制试验

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镰形扇头蜱二个cystatin分子的鉴定和酶活分析

镰形扇头蜱二个cystatin分子的鉴定和酶活分析

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第七次代表大会暨第十二次学术研讨会

作者：王玉俭曹杰周勇志李祥瑞周金林中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室200241 南京农业大学动物医学院南京中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室200241 南京农业大学动物医学院南京

利用半胱氨酸蛋白酶抑制分子在进化上相对保守的特点,分别设计保守区引物,来扩增镰形扇头蜱的家族1 cystatin和家族2 cystatin的3,端序列.再通过RACE方法获得全长基因序列.镰形扇头蜱家族1和家族2 cystatin分子分别命名为RHcyst-1和***-... 详细信息

利用半胱氨酸蛋白酶抑制分子在进化上相对保守的特点,分别设计保守区引物,来扩增镰形扇头蜱的家族1 cystatin和家族2 cystatin的3,端序列.再通过RACE方法获得全长基因序列.镰形扇头蜱家族1和家族2 cystatin分子分别命名为RHcyst-1和***-1全长基因为471bp,具有一个编码98个氨基酸的开放阅读框,没有信号肽序列和绝大多数的家族1 cystatin 一样,RHcyst-1具有N端保守甘氨酸和QXVXG保守位点.本研究成功从镰形扇头蜱中克隆了两个新的cystatin分子,并在生化水平对其抑制活性进行了分析,这对进一步了解cystatin分子在镰形扇头蜱生物学活动中的作用有着十分重要价值.

关键词：兽医学镰形扇头蜱分子鉴定酶活分析

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日本血吸虫童虫在不同敏感性宿主体内差异表达蛋白的研究

日本血吸虫童虫在不同敏感性宿主体内差异表达蛋白的研究

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上海市畜牧兽医学会2013年学术年会

作者：洪炀彭金彪蒋韦斌傅志强刘金明石耀军李祥瑞林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所/农业部动物寄生虫学重点实验室上海200241 南京农业大学动物医学院南京210095 中国农业科学院上海兽医研究所/农业部动物寄生虫学重点实验室上海200241 南京农业大学动物医学院南京210095

日本血吸虫病是一种严重危害人畜健康的热带寄生虫病。本实验的目的是为了寻找对虫体生长发育具有重要作用的虫源性蛋白，因此应用荧光差异凝胶双向电泳技术(2D-DIGE)，对BALB/c小鼠(适宜性宿主)、Wistar大鼠(非适宜宿主)和东方田鼠(抗...

日本血吸虫病是一种严重危害人畜健康的热带寄生虫病。本实验的目的是为了寻找对虫体生长发育具有重要作用的虫源性蛋白，因此应用荧光差异凝胶双向电泳技术(2D-DIGE)，对BALB/c小鼠(适宜性宿主)、Wistar大鼠(非适宜宿主)和东方田鼠(抗性宿主)体内的10d日本血吸虫童虫的可溶性蛋白表达情况进行了分析。在大鼠体内10d童虫蛋白和小鼠体内10 d童虫蛋白的比较分析中发现，有39个蛋白点存在显著性差异;在小鼠体内10 d童虫蛋白和东方田鼠体内10 d童虫蛋白的比较分析中发现，有21个蛋白点存在显著性差异。我们对差异表达蛋白进行了生物信息学分析，结果显示，这些差异表达蛋白主要参与蛋白代谢、核酸代谢、糖类代谢、应激反应及细胞骨架和运动等生物进程。本文首次对不同宿主体内的日本血吸虫10d童虫进行了蛋白质组分析，为我们更好的理解血吸虫的生长发育机制提供了依据，同时也可为抗血吸虫疫苗和潜在药物靶标的研究提供基础。

关键词：

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