检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2017年第5期33卷 863-874页

作者：赵鹏江雅王经满范浩杰曹瑞兵南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

应用毕赤酵母分泌表达日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白,鉴定其表达效果与免疫原性,以期为JEV亚单位疫苗的研制奠定基础。RT-PCR扩增JEV SA14-14-2株prME基因,将其连接到毕赤酵母表达载体pPICZa-A,分别获得pPICZa... 详细信息

应用毕赤酵母分泌表达日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白,鉴定其表达效果与免疫原性,以期为JEV亚单位疫苗的研制奠定基础。RT-PCR扩增JEV SA14-14-2株prME基因,将其连接到毕赤酵母表达载体pPICZa-A,分别获得pPICZa-prME和携带JEV Cap蛋白C末端19个Aa信号肽的pPICZa-SprME质粒。表达载体用PmeⅠ酶切线性化,通过电转化转入毕赤酵母X33并诱导发酵培养。利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定酵母发酵上清中目的蛋白的表达情况。利用GE蛋白层析纯化柱纯化目的蛋白,利用电镜观察纯化前后的目的蛋白,将不同剂量纯化后的prME蛋白与弗氏佐剂混合以及定量纯化后的prME蛋白与不同剂量的核酸佐剂混合分别免疫4周龄小鼠,定期采血,ELISA检测被免小鼠血清的抗体水平,空斑减少试验测定抗体中和效价。SDS-PAGE结果表明毕赤酵母可以分泌表达完整的prME蛋白,目的蛋白在70–100 kDa之间;Western blotting结果显示分泌表达的prME蛋白具有良好的反应原性,进一步证明prME蛋白在酵母X33中以整体的形式分泌表达,没有发生水解切割。纯化目的蛋白,根据洗脱时间和体积表明其分子量大于1×10~6 Da,因此推断prME蛋白可能形成多聚化的颗粒。电镜观察发现直径30–50 nm的病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)。免疫试验结果表明,纯化后的重组蛋白10–15μg/只接种小鼠在3周后抗体达到高峰值,之后逐渐下降,免疫7周后小鼠血清仍可检测到JEV抗体。将prME VLPs以10μg/只的剂量与不同剂量的核酸佐剂配伍后接种小鼠,ELISA检测结果表明核酸佐剂可明显增强JEV prME VLPs免疫应答,免疫4周后小鼠血清的中和抗体效价为1∶80–1∶160。上述结果表明毕赤酵母表达JEV prME虽不能发生水解切割,但仍可形成VLP并诱导免疫小鼠产生较高水平中和抗体。

关键词：日本脑炎病毒 prME蛋白毕赤酵母病毒样颗粒免疫原性

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罗非鱼源无乳链球菌灭活疫苗免疫效果的研究

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中国兽医科学 2017年第5期47卷 636-643页

作者：朱洁莲高婷婷钟孝俊刘广锦姚火春南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

将罗非鱼源无乳链球菌GD201008-001连续传50代,用API20 Strep生化鉴定试剂条和全自动生化分析仪对其各代次进行比较鉴定;将灭活疫苗以5×10~8CF U/尾分别肌肉注射和腹腔注射30 g±5 g的罗非鱼,第3次免疫后第14天,以50倍LD_(50)... 详细信息

将罗非鱼源无乳链球菌GD201008-001连续传50代,用API20 Strep生化鉴定试剂条和全自动生化分析仪对其各代次进行比较鉴定;将灭活疫苗以5×10~8CF U/尾分别肌肉注射和腹腔注射30 g±5 g的罗非鱼,第3次免疫后第14天,以50倍LD_(50)对其攻毒,记录死亡情况;在免疫后不同时间里用试剂盒检测罗非鱼肝的各个酶活指标,用RT-PCR检测头肾中IL-1β的表达量,分析其免疫保护效果。结果显示,GD201008-001各代次间生化特性稳定;肌肉注射免疫组和腹腔注射免疫组的免疫保护率分别为83.97%和93.33%,免疫前后多数酶活指标并没有显著差异(P>0.05),第3次免疫后第14天IL-1β的表达量均显著高于第1次免疫后第14天的数值,且肌肉注射方式显著高于腹腔注射(P<0.05),肌肉注射组超氧化物歧化酶活力、溶菌酶活力、总抗氧化能力、过氧化氢酶活力均略低于腹腔注射组,而丙二醛及IL-1β表达量则相反。结果表明,该无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼具有很好的免疫保护性,可以作为预防无乳链球菌感染的候选疫苗。

关键词：无乳链球菌疫苗免疫保护肌肉注射腹腔注射

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DNA核酸酶与猪链球菌9型毒力的关系

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微生物学报 2017年第4期57卷 480-489页

作者：唐欢宇任海燕吴宗福陆承平南京农业大学动物医学院江苏南京210095 农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095 世界动物卫生组织猪链球菌病参考实验室江苏南京210095

【目的】除了猪链球菌2型外,猪链球菌9型(SS9)也是目前流行血清型,同时也是人畜共患病原菌。前期研究发现,DNA核酸酶(Ssn A)存在于SS9毒力株中,在SS9无毒株中不存在。为明确Ssn A对SS9毒力的影响,本研究构建ssn A缺失株Δssn A,并研究... 详细信息

【目的】除了猪链球菌2型外,猪链球菌9型(SS9)也是目前流行血清型,同时也是人畜共患病原菌。前期研究发现,DNA核酸酶(Ssn A)存在于SS9毒力株中,在SS9无毒株中不存在。为明确Ssn A对SS9毒力的影响,本研究构建ssn A缺失株Δssn A,并研究其生物学功能。【方法】用穿梭质粒p SET-4s构建Δssn A,并通过斑马鱼毒力试验、HEp-2细胞黏附、猪全血存活和酶活检测等试验,评价Ssn A对SS9毒力的影响。【结果】斑马鱼毒力试验显示,Δssn A对斑马鱼毒力显著降低,半数致死量是野生株的11.2倍;Δssn A对HEp-2细胞的黏附率为野生株的60.61%;Δssn A在猪全血中的存活率为野生株的71.88%;酶活试验表明,Ssn A可降解线性和环状DNA。【结论】本研究表明SS9 Ssn A具有降解线性和环状DNA能力,该基因缺失后细菌对斑马鱼毒力、黏附HEp-2细胞能力、在猪全血中存活及分解DNA能力都显著降低,证实Ssn A是SS9的一个毒力因子。

关键词：猪链球菌9型 DNA核酸酶毒力因子

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猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30样毒株抗原性与致病性分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30样毒株抗原性与致病性分析

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亚洲猪病学会第8次学术会议

作者：张乔亚宋中宝吕林李亮白娟姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室南京210095

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猪链球菌2型毒力相关蛋白MRP的高变区决定细菌毒力

猪链球菌2型毒力相关蛋白MRP的高变区决定细菌毒力

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第五届全国人畜共患病学术研讨会

作者：李权张炜南京农业大学动物医学院猪链球菌OIE参考实验室农业部动物细菌学重点实验室

MRF是猪链球菌2型(SS2)重要的毒力因子且在SS2中广泛分布,但不同菌株中mrp基因序列不尽相同。分析发现,mrp在强毒株中高度保守,在弱毒株中同样也高度同源,但将强弱毒株共同比对后发现mrp基因在N端存在一段高变区(mrp1)。选取实验室保存... 详细信息

MRF是猪链球菌2型(SS2)重要的毒力因子且在SS2中广泛分布,但不同菌株中mrp基因序列不尽相同。分析发现,mrp在强毒株中高度保守,在弱毒株中同样也高度同源,但将强弱毒株共同比对后发现mrp基因在N端存在一段高变区(mrp1)。选取实验室保存的46株SS2,根据这段高变区,将菌株分成mrp1(+)和mrp1(-)两类,通过内标化的斑马鱼模型,发现mrp1(+)菌株中MRP表达水平更高且致病力更强。我们推测SS2中MRP的高变

关键词：高变区宿主蛋白猪链球菌相关蛋白 MRP

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无乳链球菌鱼源株10kb基因序列对细菌致病力的影响

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微生物学报 2016年第1期56卷 110-119页

作者：刘广锦朱洁莲石紫薇丁铭王茹怡姚火春陆承平徐跑农业部动物细菌学重点实验室南京农业大学动物医学院江苏南京210095 农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室中国水产科学研究院淡水渔业研究中心江苏无锡214081

【目的】在前期比较基因组学分析中,我们发现中国无乳链球菌鱼源株GD201008-001基因组中有一段10 kb基因序列,内含11个未知功能的开放阅读框。为了研究该段基因序列与细菌的致病力的关系,本研究将这段基因进行了全段缺失。【方法】运用... 详细信息

【目的】在前期比较基因组学分析中,我们发现中国无乳链球菌鱼源株GD201008-001基因组中有一段10 kb基因序列,内含11个未知功能的开放阅读框。为了研究该段基因序列与细菌的致病力的关系,本研究将这段基因进行了全段缺失。【方法】运用链球菌-大肠杆菌穿梭质粒p SET4s,构建了10 kb基因缺失株(Δ10 kb),并通过生物学性状的比较,细胞粘附试验,斑马鱼攻毒试验和缺失前后毒力相关基因转录水平的检测,评价该序列对无乳链球菌毒力的影响。【结果】经测序证明缺失株Δ10 kb构建成功,与亲本株GD201008-001相比较,缺失株Δ10 kb在细菌染色形态、对HEp-2细胞的粘附能力无明显差异,但在培养液中的生长速度略慢;缺失株Δ10 kb对斑马鱼的毒力明显增强,LD_(50)有极其显著的差异(P<0.001);编码菌毛骨架蛋白2b的基因(PI-2b)和唾液酸酶基因(neul)在缺失株中的转录水平明显上升。【结论】该序列对无乳链球菌GD201008-001的毒力有显著的影响,可能调控某些毒力基因的转录表达,使细菌的毒力减弱。

关键词：无乳链球菌 10 kb基因序列基因缺失斑马鱼感染模型毒力

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auf基因对禽致病性大肠杆菌鸭源株的细胞黏附及动物致病性的影响

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南京农业大学学报 2015年第4期38卷 624-629页

作者：王颢锦汤芳诸葛祥凯胡林陈玲李亚芯李德志戴建君南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

[目的]本文旨在研究禽致病性大肠杆菌auf基因的功能。[方法]利用Red同源重组技术敲除auf基因,构建DE205BΔauf缺失菌株,并分析缺失菌株和野生菌株的生物学特性及致病力差异。[结果]生物学特性试验表明:与野生菌株相比,缺失菌株的生长特... 详细信息

[目的]本文旨在研究禽致病性大肠杆菌auf基因的功能。[方法]利用Red同源重组技术敲除auf基因,构建DE205BΔauf缺失菌株,并分析缺失菌株和野生菌株的生物学特性及致病力差异。[结果]生物学特性试验表明:与野生菌株相比,缺失菌株的生长特性未发生明显改变,但对酸性(乙酸,pH 4.0和5.0,20 min)、碱性(Tris-HCl,pH 10.0,30 min)和高渗环境(2.5 mol·L-1NaCl,1 h)的耐受能力极显著降低(P<0.001),其相对存活率分别降低86.7%、77.3%、59.0%和98.3%;抗血清杀菌能力也显著下降,在100%、50%及25%稀释度的血清中极显著降低(P<0.01);DE205BΔauf缺失菌株对DF-1细胞的相对黏附能力显著降低,下降了80.7%。动物试验表明:DE205BΔauf对小鼠及雏鸭的致病力及在其体内的定殖能力均降低。[结论]auf基因在禽致病性大肠杆菌的感染及致病过程中发挥重要作用。

关键词：禽致病性大肠杆菌菌毛 auf基因黏附

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猪白细胞介素21基因的原核表达与多抗血清的制备

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中国兽医科学 2015年第4期45卷 352-355页

作者：周雪晨刘星朱雪蛟范宝超白娟姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为了制备猪白细胞介素21(porcine interleukin-21,pIL-21)的多克隆抗体,采用RT-PCR从猪外周血单个核细胞(PBMC)扩增获得pIL-21基因,然后将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a(+)之中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,pIL-21以可溶性蛋白形式表达,分子质量为35ku,具有良好的反应原性。经过Ni-NTA镍离子亲和层析纯化,获得纯化的重组蛋白pIL-21。用其免疫BALB/c小鼠制备抗pIL-21血清抗体。Western-blot分析结果显示,该抗体可与杆状病毒表达的重组Cap-pIL-21、ConA和PHA共刺激的猪PBMC细胞发生特异性反应,ELISA抗体效价可达1∶12 800。上述研究结果为pIL-21的生物学功能研究奠定了重要基础。

关键词：猪白细胞介素21 原核表达多克隆抗体

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以toxR-S为靶基因的副溶血弧菌PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2015年第10期45卷 991-999页

作者：慕艳娟许崛琼潘子豪刘永杰姚火春南京农业大学动物医学院江苏南京210095 农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

目前,副溶血弧菌PCR检测方法大多基于毒力基因或看家基因,存在假阳性和漏检的风险,建立敏感而特异的快速分子检测方法迫在眉睫。本研究在对toxRS基因序列进行系统发育树构建及同源性分析的基础上,发现toxR、toxS基因均有作为种特异性检... 详细信息

目前,副溶血弧菌PCR检测方法大多基于毒力基因或看家基因,存在假阳性和漏检的风险,建立敏感而特异的快速分子检测方法迫在眉睫。本研究在对toxRS基因序列进行系统发育树构建及同源性分析的基础上,发现toxR、toxS基因均有作为种特异性检测靶基因的可能,故分别设计引物Primers-R、Primers-S及Primers-R-S,通过优化PCR反应条件建立了相应的PCR检测方法。通过对57株副溶血弧菌和19株亲缘相近菌及食源性致病菌的检测,toxR-SPCR显示出较好的稳定性和特异性,检测极限达2pg基因组DNA。对359份市场海产品样品的比对检测结果表明,toxR-S PCR与国标(GB4789.7-2013)规定的方法的符合率高达95.82%,敏感性100%,特异性92.39%。对两种方法检测时阳性不一致的15份样品,以其总细菌DNA为模板扩增副溶血弧菌看家基因;测序比对结果显示,这15份样品与副溶血弧菌同源性高达97%以上。上述结果表明,本研究建立的toxR-S PCR具有快速、特异、敏感等优点,可被广泛用于副溶血弧菌的快速检测。

关键词：副溶血弧菌 toxR-S PCR 快速检测

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胸腺五肽和法氏囊活性五肽的融合表达及其对禽流感灭活疫苗的佐剂效应

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生物工程学报 2015年第5期31卷 648-658页

作者：王臣郭香玲李小康吴庭才李德元陈溥言河南科技大学动物科技学院兽医肿瘤免疫学重点实验室河南洛阳471003 南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

胸腺五肽(Thymopentin,TP5)和法氏囊活性五肽(Bursopentin,BP5)均具有重要的免疫学功能,但二者在基因水平上的联合应用尚未见报道。为研究TP5和BP5形成的重组融合肽TP5-BP5(TBP5)是否具有免疫佐剂活性,根据大肠杆菌偏嗜密码子设计并合... 详细信息

胸腺五肽(Thymopentin,TP5)和法氏囊活性五肽(Bursopentin,BP5)均具有重要的免疫学功能,但二者在基因水平上的联合应用尚未见报道。为研究TP5和BP5形成的重组融合肽TP5-BP5(TBP5)是否具有免疫佐剂活性,根据大肠杆菌偏嗜密码子设计并合成重组融合肽TBP5编码序列,将其克隆至p ET-32a表达载体中,重组表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达,并采用MTT法检测其表达产物的体外活性。同时以TBP5联合H9N2型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)灭活疫苗免疫小鼠,检测免疫后小鼠的HI抗体、HA抗体效价和细胞因子(IL-4和IFN-γ)的分泌水平,并通过动物免疫保护试验来评价其对小鼠的免疫保护作用。结果显示,TBP5在大肠杆菌中获得表达;TBP5能显著促进小鼠胸腺T淋巴细胞和脾脏B淋巴细胞的增殖,并能增强机体免疫后HI抗体和HA抗体效价、提高细胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平,表明TBP5既能增强机体体液免疫应答,又能增强细胞免疫应答。动物免疫保护试验结果显示TBP5有助于小鼠肺脏中H9N2型AIV病毒的清除。结果表明,重组融合肽TBP5具有良好的免疫佐剂的潜能,为进一步研究开发新型疫苗佐剂奠定了基础。

关键词：胸腺五肽法氏囊活性五肽融合表达免疫佐剂

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