检索结果-内蒙古大学图书馆

携带89K样毒力岛的猪链球菌ST665型与ST107型临床菌株的基因组及致病分析

疾病监测 2024年第5期39卷 622-628页

作者：康娓铭王鸣柳王建平张西燕吴宗福郑翰中国疾病预防控制中心传染病预防控制所北京102206 广西壮族自治区疾病预防控制中心广西南宁530028 南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

目的明确89K样毒力岛(PAI)的基因组特征及其在猪链球菌致病及耐药传播方面的作用。方法通过生物信息学方法分析89K样PAIs的基因组特征;通过接合实验比较两种89K样PAIs的转移能力;采用最小抑菌浓度法测定临床分离株及接合子的耐药谱;通过... 详细信息

目的明确89K样毒力岛(PAI)的基因组特征及其在猪链球菌致病及耐药传播方面的作用。方法通过生物信息学方法分析89K样PAIs的基因组特征;通过接合实验比较两种89K样PAIs的转移能力;采用最小抑菌浓度法测定临床分离株及接合子的耐药谱;通过C57BL/6小鼠和斑马鱼感染模型分别评估两个临床菌株及其89K样PAIs的接合子的致病性。结果携带89K样PAIs的猪链球菌临床菌株GX54和GX82的序列型(ST)分别为ST665和ST107。菌株GX54携带的PAI大小为75Kb,在核苷酸水平上与ST7流行型菌株携带的89K PAI具有99.21%的相似性和79.00%的覆盖率,而菌株GX82携带的PAI大小为87Kb,与89K PAI具有98.80%的相似性和86.00%的覆盖率。这两个PAIs的插入位点与89K PAI相同,均位于rplL位点,且PAIs的两端均含有一段15 bp的att序列(5’-TTATTTAAGAGTAAC-3’)。此外,这两个PAIs均具有完整的模块化结构,包含完整的NisK-NisR样双组分信号转导系统和IV型分泌系统(T4SS)。而在SalR-SalK样双组分信号转导系统中,仅SalR基因保持完整,SalK基因发生错义突变。与89K PAI相比,本研究中的两个PAIs在基因组成上呈现出一定的差异。75K PAI插入了4个基因,包括两个假定蛋白基因和两个耐药基因tet(O)和erm(B)。而87K PAI则插入了12个基因,主要涉及编码与质粒相关的重组酶和假基因,以及与耐药相关的cat、tet(L)、erm(B)基因。此外,还包括编码转座酶、拓扑异构酶等基因。菌株GX54携带的75K PAI的转移频率为4.61×10−5,显著高于菌株GX82携带的87K PAI的转移频率8.46×10^(−6)。与受体菌P1/7RIF相比,两个89K样PAIs的接合子P1/7RIF-GX54与P1/7RIF-GX82的四环素类和大环内酯类抗生素的抗性水平,以及对斑马鱼的致病力均显著增加,且两接合子组间的致病力差异无统计学意义(P>0.05)。菌株GX54和菌株GX82感染C57BL/6小鼠后,菌株GX54感染组小鼠死亡率显著高于菌株GX82感染组(P<0.05)。攻毒8 h后,两感染组小鼠的外周血细菌载量无统计学意义(P>0.05),但菌株GX54感染组小鼠血清中的TNF-α水平显著高于菌株GX82感染组小鼠(P<0.05),而IL-6水平在两感染组间无统计学意义(P>0.05)。sly、mrp、epf,ofs,revS,nadR,SSU05_0473,neuB及neuC等在高致病型猪链球菌中常见的毒力基因在GX54与GX82也存在。结论本研究首次发现了猪链球菌ST665和ST107型临床菌株携带可移动的89K样PAIs。携带不同89K样PAIs的菌株毒力水平具有显著差异,该差异与菌株在感染早期诱导宿主产生TNF-α的水平密切相关,且并非由外周血中的细菌载量差异所引起。仅以包括89K样PAIs在内的已知毒力基因存在与否做为判断猪链球菌毒力水平的方法存在不足。

关键词：猪链球菌 89K样毒力岛接合耐药性致病

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塞内卡病毒A VP2蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2021年第9期51卷 1097-1105页

作者：孙培培朱慧欣延君芳刘文文姜平白娟南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为加强塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)的鉴别诊断及流行病学监测。本研究以SVA重组VP2蛋白及其对应的辣根过氧化酶(HRP)标记的单克隆抗体,建立了检测SVA抗体的阻断ELISA方法。该方法优化后,抗原最佳包被浓度为0.25μg/m L,37℃孵育2 h... 详细信息

为加强塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)的鉴别诊断及流行病学监测。本研究以SVA重组VP2蛋白及其对应的辣根过氧化酶(HRP)标记的单克隆抗体,建立了检测SVA抗体的阻断ELISA方法。该方法优化后,抗原最佳包被浓度为0.25μg/m L,37℃孵育2 h后4℃过夜;最佳封闭液为1%BSA,37℃孵育1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,37℃孵育1.5 h;酶标单抗最佳稀释度为1∶1000,37℃作用45 min;TMB最佳显色时间为37℃作用10~15 min。本方法的判定标准:当阻断率(PI)≥41.25%时为阳性,PI≤25.29%时为阴性,25.29%

关键词：塞内卡病毒A VP2蛋白单克隆抗体阻断ELISA

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非洲猪瘟病毒p30和pK205R双抗原间接ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2024年第11期54卷 1443-1450页

作者：何佳依邹艳丽王燕刘珊苗雨润任炜杰王振忠白昀陈欢贾红郑龙三吴晓东冯志新钱莺娟南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095 中国动物卫生与流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室山东青岛266032 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

为建立一种可靠、快速的血清学检测方法,以非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白p30和非结构蛋白pK205R作为包被抗原,建立了一种双抗原间接ELISA方法,用于检测ASFV抗体。结果表明,该方法与伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪... 详细信息

为建立一种可靠、快速的血清学检测方法,以非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白p30和非结构蛋白pK205R作为包被抗原,建立了一种双抗原间接ELISA方法,用于检测ASFV抗体。结果表明,该方法与伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒和猪瘟病毒等常见猪源病原阳性血清无交叉反应;对ASFV阳性血清的敏感性能达到1∶12800;批内变异系数为7.95%,批间变异系数为9.18%,均小于10%。利用该方法与***商品化ELISA试剂盒分别检测130份临床猪血清,其阳性符合率为92.19%,阴性符合率为86.36%,总符合率为89.23%。综上所述,成功建立了ASFV p30和pK205R双抗原间接ELISA检测方法,为检测猪血清中ASFV特异性抗体提供了新的技术支持。

关键词：非洲猪瘟病毒 p30蛋白 pK205R蛋白间接ELISA

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宿主细胞敲除G3BP2基因对塞内卡病毒复制的影响

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畜牧与兽医 2025年第1期57卷 91-97页

作者：郭承意董钰蓓温家成延君芳高雁怩姜平白娟南京农业大学动物医学院江苏南京 210095 南京农业大学动物医学院江苏南京 210095 农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京 210095

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Ras GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白2(G3BP2)基因敲除的293T细胞系,并初步探讨了G3BP2基因缺失对于塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)增殖的影响.采用激光共聚焦试验观察病毒感染是否引起应激颗粒的产生... 详细信息

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Ras GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白2(G3BP2)基因敲除的293T细胞系,并初步探讨了G3BP2基因缺失对于塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)增殖的影响.采用激光共聚焦试验观察病毒感染是否引起应激颗粒的产生;设计、构建靶向G3BP2基因的px459-sgRNA表达载体并转染进293T细胞;通过嘌呤霉素压力筛选以及亚克隆得到细胞株,经过Western blot、基因测序的方式鉴定细胞株;CCK-8法测定细胞增殖速度;Western blot、RT-qPCR、噬斑试验分别检测SVA感染后病毒蛋白VP1的表达水平、VP1的拷贝数和细胞上清液的病毒滴度;设计并构建SVA核糖体进入位点(IRES)的双荧光素酶报告系统,双荧光素酶报告试验测定病毒启动子的启动活性.结果:病毒感染引起应激颗粒的产生;筛选得到1株G3BP2基因缺失10 bp的293T细胞系(HEK 293T G3BP2-/-),其细胞活力与未敲除细胞相比无显著差异;Western blot、RT-qPCR、噬斑试验均显示G3BP2敲除后显著抑制了病毒的增殖;双荧光素酶报告试验表明G3BP2敲除后下调了病毒的翻译启动活性.综上,本研究获得了 1株HEK 293TG3BP2-/-细胞系,该细胞通过下调病毒的启动活性抑制病毒的增殖,为进一步探讨G3BP2对SVA复制的影响奠定基础.

关键词： G3BP2基因基因敲除塞内卡病毒A 复制

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蓝舌病病毒小反刍兽疫病毒羊口疮病毒和山羊痘病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2022年第12期52卷 1510-1517页

作者：勾倩倩杜吉革朱真陈小云赵辉赵洋钱莺娟印春生中国兽医药品监察所北京100081 南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)和山羊痘病毒(CaPV)的方法,基于TaqMan探针技术,分别以NS3、N、F1L和P32为靶基因设计特异性探针和引物。以特异性引物扩增目的基因并构建重组质粒标准... 详细信息

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)和山羊痘病毒(CaPV)的方法,基于TaqMan探针技术,分别以NS3、N、F1L和P32为靶基因设计特异性探针和引物。以特异性引物扩增目的基因并构建重组质粒标准品。通过优化反应体系建立多重荧光定量PCR检测方法,并用此方法检测临床样品。结果显示,该多重荧光定量PCR标准曲线呈线性关系,对BTV、PPRV、ORFV和CaPV的扩增效率分别为100%、91%、91%、95%;该方法具有较高的灵敏性和特异性,对BTV、PPRV、ORFV和CaPV阳性质粒的最低检出量分别为17、12、8和9 copies/μL,与口蹄疫病毒、腐败梭菌、布鲁菌及弓形虫无交叉反应;其重复性较好,组间变异系数和组内变异系数均小于5%。对232份样品进行检测,用该多重荧光定量PCR分别检出9份BTV、3份PPRV、3份CaPV和24份ORFV阳性样品,而用常规PCR分别检出7份BTV、3份PPRV、0份CaPV、12份ORFV阳性样品。综上,该方法能够同时检测BTV、PPRV、ORFV和CaPV,可用于羊病的鉴别诊断、流行病学调查和疫病防控。

关键词：蓝舌病病毒小反刍兽疫病毒羊口疮病毒山羊痘病毒多重荧光定量PCR

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BTV和PPRV双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第3期52卷 285-291页

作者：勾倩倩杜吉革李启红李倩琳赵洋钱莺娟印春生郑龙三南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095 中国兽医药品监察所北京100081

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)的快速检测方法,本研究选取蓝舌病病毒的NS3基因和小反刍兽疫病毒的N基因作为靶基因,参照GenBank上公布的两种基因序列,通过序列比对后选取一段保守性较高的区域,利用Beaco... 详细信息

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)的快速检测方法,本研究选取蓝舌病病毒的NS3基因和小反刍兽疫病毒的N基因作为靶基因,参照GenBank上公布的两种基因序列,通过序列比对后选取一段保守性较高的区域,利用Beacon designer 8设计引物和探针并优化反应体系及反应条件,建立了双重荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法检测BTV和PPRV阳性质粒标准品的最低检出量分别为1.7 copies/μL和1.2 copeis/μL;与山羊痘病毒、羊口疮病毒、口蹄疫病毒、羊腐败性梭菌、布氏杆菌及弓形虫无交叉反应,具有良好的特异性;其组间重复性和组内重复性的变异系数均小于2%,表明该方法具有较好的重复性。结果表明,建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法适用于BTV和PPRV的快速检测。

关键词：蓝舌病病毒小反刍兽疫病毒双重荧光定量RT-PCR

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牛结节性皮肤病病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立与应用

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畜牧与兽医 2022年第11期54卷 100-105页

作者：伍子昂南文龙吴晓东王怡王俊荣高雁怩白娟杨振姜平南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室/“一带一路”国际重大跨境动物疫病诊断与免疫专业科技创新院江苏南京210095 中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032

牛结节性皮肤病(lumpy skin disease, LSD)是近年来我国新出现的一种牛传染性疾病。本研究根据LSD病毒(LSDV)的LSD022基因保守区域,设计出引物和探针,经过反应条件优化,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,测试了其敏感性、特异性和... 详细信息

牛结节性皮肤病(lumpy skin disease, LSD)是近年来我国新出现的一种牛传染性疾病。本研究根据LSD病毒(LSDV)的LSD022基因保守区域,设计出引物和探针,经过反应条件优化,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,测试了其敏感性、特异性和重复性。结果发现,本方法敏感性达到15 copies/μL,不与其他牛病病毒和山羊痘弱毒疫苗AV41发生反应,变异系数均小于3%。用本方法和OIE推荐的普通PCR方法检测发病牛场94份临床样品,LSDV检出率分别为62%和37%,其中阳性样品2种方法检测符合率为96.7%,说明本方法敏感性、特异性和重复性较好,可用于LSDV检测。

关键词：牛结节性皮肤病 TaqMan探针实时荧光定量PCR

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法氏囊活性肽BP7和BP9调节T细胞的功能研究

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畜牧与兽医 2021年第5期53卷 88-93页

作者：张则郑阳郝珊珊蔡佳希冯秀丽南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室/教育部“动物健康与食品安全”国际合作联合实验室江苏南京210095

旨在探索法氏囊活性肽BP7和BP9调节T细胞亚型的功能。采用禽流感灭活疫苗免疫小鼠,利用磁珠CD3阴选分选免疫小鼠T细胞,再用法氏囊多肽BP7和BP9刺激T细胞,检测T细胞活力及亚型变化情况。MTT结果表明,BP7和BP9均能提高活化T细胞的活力水平... 详细信息

旨在探索法氏囊活性肽BP7和BP9调节T细胞亚型的功能。采用禽流感灭活疫苗免疫小鼠,利用磁珠CD3阴选分选免疫小鼠T细胞,再用法氏囊多肽BP7和BP9刺激T细胞,检测T细胞活力及亚型变化情况。MTT结果表明,BP7和BP9均能提高活化T细胞的活力水平;流式分析图显示,法氏囊多肽BP7促进活化T细胞增殖分化成CD3^(+)CD4^(+)T细胞和CD3^(+)CD8^(+) T细胞,而BP9在48 h促进CD3^(+)CD8^(+) T细胞比例增加,但未达到差异水平;细胞凋亡结果显示,BP7和BP9均能抑制T淋巴细胞早期凋亡。此外,ELISA检测表明,BP7促进T细胞分泌IL-4和IFN-γ。以上结果表明:法氏囊活性肽BP7和BP9均参与T细胞分化成熟反应,但其调节功能略有差异。

关键词：法氏囊活性肽BP7 BP9 H9N2灭活疫苗 T细胞亚型

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泛素化激酶Cbl蛋白对H9N2亚型禽流感病毒早期复制的抑制作用

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畜牧与兽医 2021年第6期53卷 78-83页

作者：陈佳静李彤彤张则卢安然李陈飞冯秀丽南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室/教育部“动物健康与食品安全”国际合作联合实验室江苏南京210095

为研究Cbl蛋白(Casitas b-lineage lymphoma)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,采用PCR技术扩增Cbl基因片段并连接到FLAG-N载体中,Western blot技术验证FLAG-Cbl重组载体表达及病毒NP蛋白的表达情况,并采用荧光定量PCR技术检测病毒... 详细信息

为研究Cbl蛋白(Casitas b-lineage lymphoma)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,采用PCR技术扩增Cbl基因片段并连接到FLAG-N载体中,Western blot技术验证FLAG-Cbl重组载体表达及病毒NP蛋白的表达情况,并采用荧光定量PCR技术检测病毒的血凝素(HA)、核蛋白(NP)和非结构蛋白(NS)基因水平;采用RNAi技术检测Cbl对病毒HA基因表达水平的影响。结果显示:EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定及测序分析发现,成功构建真核表达重组载体FLAG-Cbl;Western blot结果证实H9N2亚型AIV感染FLAG-Cbl重组载体转染的A549细胞6 h时,病毒NP蛋白表达降低;荧光定量PCR结果证实病毒NP、NS及HA基因在AIV感染FLAG-cbl重组载体转染的A549细胞的6和12 h时表达水平均明显降低;RNAi敲低A549细胞内源性Cbl蛋白后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12、24和36 h明显升高。结果表明:Cbl蛋白能在早期抑制H9N2亚型AIV在A549细胞上的复制,为深入研究Cbl蛋白抗病毒复制的机制提供了重要的试验依据,同时为开展抗AIV的药物研发提供了参考。

关键词： Cbl蛋白 H9N2亚型AIV 重组蛋白表达病毒基因表达 siRNA

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猪链球菌分子流行病学研究方法

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微生物学报 2021年第12期61卷 3928-3936页

作者：杨诗鑫卞晨吴宗福南京农业大学动物医学院江苏南京210014 农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210014 世界动物卫生组织猪链球菌病参考实验室江苏南京210014

猪链球菌(Streptococcus suis)是猪重要的细菌性病原,它可以导致猪的脑膜炎、败血症和关节炎等症状,给养猪业带来严重经济损失;同时该菌还可感染人,是一种人畜共患病原菌。应用分子流行病学方法,阐明猪链球菌病的流行病学特征,明确其毒... 详细信息

猪链球菌(Streptococcus suis)是猪重要的细菌性病原,它可以导致猪的脑膜炎、败血症和关节炎等症状,给养猪业带来严重经济损失;同时该菌还可感染人,是一种人畜共患病原菌。应用分子流行病学方法,阐明猪链球菌病的流行病学特征,明确其毒力分型、时空分布、传播途径、传染源,确定传播的遗传决定因素等,将有助于猪链球菌病的防控。目前常用的分子流行病学方法主要有多位点序列分型、脉冲场凝胶电泳、全基因组测序和基于PCR的方法等。本文介绍了上述方法的原理以及在猪链球菌流行病学中的应用,并分析这几种方法的优缺点,从而为更好地揭示猪链球菌流行病学特征、制定猪链球菌病的防控策略提供参考。

关键词：猪链球菌流行病学多位点序列分型脉冲凝胶电泳全基因组测序

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