检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2019年第7期49卷 821-827页

作者：于洁刘雪威白娟宋中宝姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室

为了鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白抗原表位,本研究将PRRSV N蛋白进行了原核表达和纯化,并用纯化后的N蛋白免疫BALB/c小鼠。利用淋巴瘤细胞融合技术和间接ELISA抗体筛选方法,制备获得4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D10... 详细信息

为了鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白抗原表位,本研究将PRRSV N蛋白进行了原核表达和纯化,并用纯化后的N蛋白免疫BALB/c小鼠。利用淋巴瘤细胞融合技术和间接ELISA抗体筛选方法,制备获得4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D10、3G12、6E2和6F4,Western-blot和IFA鉴定其均能与PRRSV特异性反应。4株单抗均属于IgG1亚类,轻链均为κ链。ELISA结果显示,3D10、3G12、6E2和6F4之间的叠加系数均在50%以上。选择N蛋白3个主要抗原表位合成肽进行ELISA检测,证明4株单抗识别的抗原表位均为30~52 aa,提示4株单克隆抗体亲和力可能存在一定差异,为该病毒研究提供了重要材料。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体 N蛋白

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猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立与应用

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中国兽医科学 2019年第12期49卷 1505-1513页

作者：张杰刘雪威白娟宋中宝姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室

本研究根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计出一对引物,建立了检测该病毒的SYBR GreenⅠ染料荧光定量PCR方法。此法特异性高,与猪流行性腹泻(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、塞内卡谷病毒(SVV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、伪狂犬病... 详细信息

本研究根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计出一对引物,建立了检测该病毒的SYBR GreenⅠ染料荧光定量PCR方法。此法特异性高,与猪流行性腹泻(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、塞内卡谷病毒(SVV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应;采用不同滴度的PRRSV测定,当Ct≤32且有明显的指数扩增曲线,判定为PRRSV阳性,Ct>32或者无Ct值则判定为PRRSV阴性。该方法检测下限为1×10^0.5TCID50病毒,高于常规RT-PCR国家标准(GB/T18090-2008),批内和批间变异系数均小于1%。PRRSV人工感染仔猪15份肺脏组织和60份血清样品检测结果均为阳性,SPF仔猪8份肺脏组织和25份血清检测结果均为阴性。采集245份临床仔猪肺脏组织病料检测,PRRSV阳性率为67.35%,明显高于普通RT-PCR检测阳性率(56.33%)。上述结果表明,本方法可用于PRRSV临床病料检测。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征 SYBR GreenⅠ 实时荧光定量PCR

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猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白在昆虫细胞中的分泌表达与免疫特性研究

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中国兽医科学 2019年第8期49卷 983-989页

作者：高莹白娟宋中宝姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室

以猪瘟病毒石门株E2囊膜糖蛋白基因序列为基础,构建了3种重组杆状病毒rAc-E2、rAc-E2oKm和rAc-HE2oKm。Western-blot和间接免疫荧光试验结果显示,这3种重组杆状病毒均可正确表达重组E2蛋白,与E2蛋白和His的单克隆抗体均有良好的抗原反... 详细信息

以猪瘟病毒石门株E2囊膜糖蛋白基因序列为基础,构建了3种重组杆状病毒rAc-E2、rAc-E2oKm和rAc-HE2oKm。Western-blot和间接免疫荧光试验结果显示,这3种重组杆状病毒均可正确表达重组E2蛋白,与E2蛋白和His的单克隆抗体均有良好的抗原反应特性,其中rAc-HE2oKm可分泌表达重组E2蛋白,可形成病毒样颗粒,可诱导免疫仔猪产生高水平抗体和中和抗体,免疫效果与猪瘟活疫苗相当,为猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗研究奠定了重要基础。

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白亚单位疫苗

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羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会暨中国畜牧兽医学会生物制品学分会2021年学术论坛

作者：勾倩倩钱莺娟印春生南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部细菌学重点实验室中国兽医药品监察所

羊痘（Capripox）是由羊痘病毒（Capripoxvirus）引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病,被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病。羊痘病毒为痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒属（Capripoxvirus）成员,包括绵羊痘病毒（Sheeppoxvi... 详细信息

羊痘（Capripox）是由羊痘病毒（Capripoxvirus）引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病,被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病。羊痘病毒为痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒属（Capripoxvirus）成员,包括绵羊痘病毒（Sheeppoxvirus）、山羊痘病毒（Goatpoxvirus）和牛结节性皮肤病病毒（Lump skin disease virus）。山羊和绵羊都易感染此病毒,羔羊感染后能够引起较高的死亡率,妊娠母羊甚至引起流产。该病对畜牧养殖业和国际贸易产生严重的影响。本研究建立一种方便快捷的荧光定量PCR检测方法,对该病毒进行高效、准确的鉴别诊断。共分为以下四部分:1.选择羊痘病毒保守区的ORF74号基因作为目的基因。利用Beacon designer 8设计多条引物和探针,经过Blast和分析,扩增片段为92bp。在探针的5’端用RED标记,3’端用MGB标记。2.提取山羊痘病毒疫苗株AV41株的核酸,用设计的上下游引物进行目的片段的扩增,之后将其连接于pTopo-Blunt载体,用DH5α进行转化,建立质粒标准品。3.利用正交法优化引物和探针的浓度,选取Ct值较低和荧光信号强度较高所对应的的引物和探针浓度为最佳反应体系。4.建立荧光定量标准曲线,分析扩增效率,并对其敏感性,特异性和重复性进行测定。结果表明,标准曲线斜率-3.436,相关系数R为0.9999,扩增效率达到95.45%。将质粒进行10倍系列连续稀释经检测该方法能检出最低拷贝数为9拷贝数/1,以蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒、布氏杆菌、羊口疮病毒、羊腐败梭菌的核酸为模板进行特异性检测,仅有羊痘病毒有扩增曲线,表明该方法特异性良好。检测其组间重复性和组内重复性的变异系数均小于2%,表明该方法重复性良好。最后采集发病羊的病料,提取DNA进行检测,均能检出病毒核酸,阴性对照未检出。表明所建立的基于ORF74基因建立的实时荧光定量PCR检测方法适用于羊痘病毒的快速检测。

关键词：羊痘实时荧光定量PCR ORF74基因

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低致病性A/Anhui/1/2013(H_7N_9)流感病毒感染小鼠肺组织的miRNA表达谱分析

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南京农业大学学报 2019年第3期42卷 482-490页

作者：郭艳娜刘志远孙彤彤黄楠赵锦华刘清政平继辉周继勇南京农业大学动物医学院江苏南京210095 浙江大学农业农村部动物病毒学重点实验室浙江杭州310058

[目的]本试验旨在利用基因芯片测序技术分析宿主miRNA在调控流感病毒感染小鼠肺组织过程中的作用。[方法]应用低致病性H_7N_9亚型A/Anhui/1/2013流感病毒及PBS感染BALB/c小鼠,感染后3 d取小鼠肺组织分别利用转录组测序技术和miRNA芯片... 详细信息

[目的]本试验旨在利用基因芯片测序技术分析宿主miRNA在调控流感病毒感染小鼠肺组织过程中的作用。[方法]应用低致病性H_7N_9亚型A/Anhui/1/2013流感病毒及PBS感染BALB/c小鼠,感染后3 d取小鼠肺组织分别利用转录组测序技术和miRNA芯片测序技术筛选差异表达mRNA和miRNA,并利用RT-qPCR验证差异miRNA。之后分别采用Targetscan、PITA及microRNAorg软件预测靶基因并结合转录组mRNA信息筛选候选miRNA的假定靶基因,最后利用Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes(KEGG)分析差异miRNA的生物学功能及其可能调控的信号通路。[结果]与PBS组相比,低致病性H_7N_9病毒感染组共筛选到265个差异表达miRNA,其中143个miRNA显著上调,122个miRNA显著下调。差异表达miRNA经RT-qPCR验证,10条候选miRNA的RT-qPCR结果与芯片结果有非常好的一致性。进一步KEGG分析表明,这些差异表达miRNA主要富集在Rap1、PI3K-Akt、Hippo、MAPK、Wnt、黏着斑、自噬等免疫相关信号通路中。结合差异mRNA信息进行miRNA-mRNA调控网络分析,显示主要有15条差异表达miRNA和31个差异靶基因富集到这些信号通路中。[结论]成功筛选到了低致病性H_7N_9感染小鼠肺组织后引起的差异表达miRNA,且RT-qPCR证明其与基因芯片测序结果表达趋势具有很好的一致性,为深入研究宿主miRNA在调控低致病性H_7N_9流感病毒与宿主相互作用的分子机制奠定了基础。

关键词：低致病性H7N9流感病毒 miRNA 基因芯片测序表达谱

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链球菌神经氨酸酶的作用机制及酶活性的测定技术

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微生物学报 2019年第3期59卷 433-441页

作者：范玉凤刘广锦南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

神经氨酸酶不仅存在于流感病毒,在细菌中也有分布。细菌的神经氨酸酶可裂解宿主体内糖结合物末端的神经氨酸残基,有助于细菌实现在宿主体内的定殖、穿透和扩散,是细菌重要的毒力因子之一。链球菌是自然界广泛存在的人畜共患的病原菌,在... 详细信息

神经氨酸酶不仅存在于流感病毒,在细菌中也有分布。细菌的神经氨酸酶可裂解宿主体内糖结合物末端的神经氨酸残基,有助于细菌实现在宿主体内的定殖、穿透和扩散,是细菌重要的毒力因子之一。链球菌是自然界广泛存在的人畜共患的病原菌,在多种链球菌中均可检测出神经氨酸酶。肺炎链球菌的神经氨酸酶研究最为透彻,该菌可产生3种神经氨酸酶(NanA,NanB,NanC),NanA不但可以发挥酶的催化作用,分解唾液酸残基,暴露细菌的黏附受体,还能不依赖酶活基团,辅助细菌感染宿主细胞;NanB催化后产物可作为细菌的碳源;NanC可辅助细菌入侵脑部。在无乳链球菌和猪链球菌中,神经氨酸酶的活性一直未得到确切的验证,可能是由于它们的荚膜均含有神经氨酸,所以其神经氨酸酶的活性逐渐在进化中丧失。另外一些链球菌,例如化脓链球菌和C、G、L群链球菌,其神经氨酸酶的底物偏好相近,均对唾液类黏蛋白的催化活性较强,利于链球菌在含唾液类黏蛋白的组织中扩散。在口腔链球菌和血链球菌中,神经氨酸酶破坏血液成分中的神经氨酸链。由此可见,神经氨酸酶的特异性催化作用与链球菌在宿主体内的定植部位密切相关。此外,随着科技的发展,对神经氨酸酶的活性检测,也由早期的硫代巴比妥法,转为现在的荧光值和吸光度的测定,更为便捷和敏感。本文旨在对链球菌的神经氨酸酶的作用机制、与毒力关系及酶活测定方法等研究进展作一综述,为从事相关研究的科学工作者提供参考。

关键词：链球菌神经氨酸酶致病性酶活性

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非洲猪瘟流行病学及其在中国扩散的因素分析

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病毒学报 2019年第3期35卷 512-522页

作者：张睿黄旖童鲍晨沂 JUNGYong Sam 许家荣钱莺娟戴建君南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部细菌学重点实验室南京210000

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高度传染性和致死性疫病。2018年8月1日,国家外来动物疫病中心接到辽宁省沈阳市发生疑似ASF病例的报告,经官方确认后于201... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高度传染性和致死性疫病。2018年8月1日,国家外来动物疫病中心接到辽宁省沈阳市发生疑似ASF病例的报告,经官方确认后于2018年8月3日向世界动物卫生组织(OIE)通报为我国首例非洲猪瘟。截至2019年4月22日,中国已相继暴发了129起ASF疫情,共计扑杀102万头猪。由于尚无针对ASF的有效疫苗,其传播媒介广泛分布及复杂的相互作用使得防控局势变得更为严峻。扑杀猪群和切断病毒的传播路径是目前减缓疫情传播的主要手段。因此,对ASF流行病学特点及其扩散因素的深刻理解,有助于病毒扩散模型的建立和进一步防控措施的实施。

关键词：非洲猪瘟(ASF) 非洲猪瘟病毒(ASFV) 流行病学扩散因素产业链

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非洲猪瘟病毒p30单克隆抗体的制备和鉴定

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中国兽医科学 2020年第8期50卷 976-981页

作者：杨莎莎苗雨润薄宗义王振忠谭凯鲍晨沂吴晓东陈鸿军郑龙三钱莺娟戴建君南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部细菌学重点实验室江苏南京210095 中国动物卫生与流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室山东青岛266000 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

p30蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的膜蛋白,在病毒感染早期分泌表达,含量丰富且抗原性较高,是重要的病毒早期诊断靶标。本研究以ASFV基因Ⅱ型格鲁吉亚2007株p30基因的质粒为模板扩增p30基因片段,连接至原核表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌Ro... 详细信息

p30蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的膜蛋白,在病毒感染早期分泌表达,含量丰富且抗原性较高,是重要的病毒早期诊断靶标。本研究以ASFV基因Ⅱ型格鲁吉亚2007株p30基因的质粒为模板扩增p30基因片段,连接至原核表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌Rosetta后,经IPTG诱导表达和镍柱纯化;将纯化后的重组p30蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合和间接ELISA方法,筛选出了2株能够稳定分泌抗p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,并通过制备腹水的方法获得单克隆抗体;最后经Western-blot和IFA试验鉴定,其均能与ASFV感染细胞发生特异性反应。本研究为ASFV感染的诊断和致病机制研究提供了重要材料。

关键词：非洲猪瘟病毒 p30蛋白单克隆抗体

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H9N2亚型禽流感病毒NA和M2基因的克隆与表达

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畜牧与兽医 2019年第5期51卷 121-127页

作者：郝珊珊郑阳余远楠张则蔡佳希宗嫚嫚冯秀丽南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点实验室/教育部"动物健康与食品安全"国际合作联合实验室江苏南京210095

旨在分别构建NA蛋白和M2蛋白的重组质粒,并进行表达鉴定。采用PCR扩增了H9N2分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017毒株的NA基因和M2基因。同源性分析证实,这2个基因序列与目前流行毒株的基因同源性很高。将NA基因克隆至pcold1原核表达载体... 详细信息

旨在分别构建NA蛋白和M2蛋白的重组质粒,并进行表达鉴定。采用PCR扩增了H9N2分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017毒株的NA基因和M2基因。同源性分析证实,这2个基因序列与目前流行毒株的基因同源性很高。将NA基因克隆至pcold1原核表达载体,将M2基因克隆至pET28a原核表达载体,成功构建了pcold1-NA和pET28a-M2重组质粒,并成功表达出相应的融合蛋白。然后对表达的融合蛋白进行纯化,并采用免疫印迹验证其免疫反应性。本试验为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒致病机制及检测技术奠定了基础。

关键词： H9N2禽流感病毒 NA基因 M2基因原核表达

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CBL蛋白表达对H9N2亚型禽流感病毒细胞中复制及感染细胞凋亡的影响

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畜牧与兽医 2019年第5期51卷 108-113页

作者：郑阳郝珊珊张则蔡佳希宗嫚嫚余远楠田晓宁冯秀丽南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点实验室/教育部"动物健康与食品安全"国际合作联合实验室江苏南京210095

CBL蛋白是一种E3泛素连接酶,在免疫调控、信号传导调节和对多种刺激的反应中起重要作用。本研究的主要目的是探讨真核表达的CBL蛋白对H9N2禽流感病毒增殖及感染细胞的凋亡情况的影响。荧光显微镜下观察真核表达重组载体EGFP-CBL在MDCK... 详细信息

CBL蛋白是一种E3泛素连接酶,在免疫调控、信号传导调节和对多种刺激的反应中起重要作用。本研究的主要目的是探讨真核表达的CBL蛋白对H9N2禽流感病毒增殖及感染细胞的凋亡情况的影响。荧光显微镜下观察真核表达重组载体EGFP-CBL在MDCK细胞内正常表达,qPCR结果证实禽流感病毒H9N2亚型感染的转染EGFP-CBL重组载体的MDCK细胞内病毒滴度明显少;Western blot结果证实禽流感病毒H9N2亚型感染的转染EGFP-CBL重组载体的MDCK细胞36 h,其凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值较大;流式分析结果显示转染EGFP-CBL重组载体的MDCK的早期凋亡细胞的比例少,暗示CBL蛋白能够一定程度上抑制MDCK细胞的凋亡。该结果表明CBL蛋白能在一定程度上抑制H9N2禽流感病毒在MDCK细胞的扩增,并且抑制细胞的凋亡,为深入研究CBL蛋白抗病毒细胞机制提供了重要的试验依据。

关键词： CBL 真核表达 H9N2亚型病毒细胞凋亡

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