检索结果-内蒙古大学图书馆

华北农学报 2018年第5期33卷 106-110页

作者：刘娜刘青涛李银杨婧李祥瑞江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片... 详细信息

通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。

关键词：血清4型禽腺病毒六邻体蛋白原核表达

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猪链球菌2型IMPDH基因功能结构域的研究

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2009年第2期30卷 5-8页

作者：刘亚彬何孔旺倪艳秀周俊明张雪寒陆承平江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

在猪链球菌毒力相关基因orf2和mrp之间发现一个新的开放阅读框,经酶活性染色试验证实该阅读框编码的蛋白具有次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)活性,该阅读框共计957 bp,编码319个氨基酸。经Interpro和PHD软件分析,推测该蛋白的功能结构域存... 详细信息

在猪链球菌毒力相关基因orf2和mrp之间发现一个新的开放阅读框,经酶活性染色试验证实该阅读框编码的蛋白具有次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)活性,该阅读框共计957 bp,编码319个氨基酸。经Interpro和PHD软件分析,推测该蛋白的功能结构域存在于9~798 bp基因片段所编码的多肽中,特对这790个碱基依次缺失,以找寻酶的催化部位和底物结合部位。4个缺失基因和全长基因经过基因克隆,表达出5种相应的蛋白。免疫印迹证实这5种蛋白可被猪链球菌2型(SS2)的抗血清识别,且其中的4种蛋白含有IMPDH单抗(1A8)识别表位;通过活性染色,初步确定了SS2中IMDPH的催化部位和底物结合部位。

关键词：猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶结构域活性染色

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大肠杆菌O157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

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中国预防兽医学报 2010年第5期32卷 375-378页

作者：刘洁夏兴霞王永山张雪寒费荣梅何孔旺江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为建立快速检测鼠感染大肠杆菌O157∶H7后的抗体,本研究采用颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG,制备金标探针,喷涂于玻璃纤维膜上;将大肠杆菌O157∶H7抗原和抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体F1分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测... 详细信息

为建立快速检测鼠感染大肠杆菌O157∶H7后的抗体,本研究采用颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG,制备金标探针,喷涂于玻璃纤维膜上;将大肠杆菌O157∶H7抗原和抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体F1分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,组装成鼠血清O157∶H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条。实验结果表明,该试纸条仅与O157∶H7阳性鼠血清发生特异性反应,用该试纸条与常规间接ELISA平行比较检测O157∶H7免疫鼠血清,抗体效价分别为1×106和1×105,两者的敏感度相当。该试纸条操作简便,10min可出结果,适用于调查与追溯鼠O157∶H7感染状况时的现场检测。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157∶H7 胶体金免疫层析试纸条鼠

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乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

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中国病毒学 2005年第2期20卷 117-120页

作者：葛菲菲邱亚峰杨耀武陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095 中国预防医学科学院病毒研究所北京100052

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14 14 2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZαA,以电穿孔法转化酵母X 33,用Zeocin平板筛选... 详细信息

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14 14 2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZαA,以电穿孔法转化酵母X 33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS PAGE和免疫印迹分析表达产物。由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性。在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据。

关键词：乙脑疫苗株SA14—14—2株 E蛋白基因主要抗原片段巴斯德毕赤酵母高效表达

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非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达

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中国预防兽医学报 2011年第8期33卷 625-629页

作者：毕振威王永山范红结王智群吴晓悠马金荣欧阳伟张海彬江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与... 详细信息

为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%～99.2%和97.9%～99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%～93.6%和96.4%～97.5%之间;在N基因系统发育进化树上,非典型CDV与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。N基因在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62 ku,主要以包涵体的形式存在;用western blot分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应;以纯化的重组N蛋白为抗原建立的CDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。

关键词：犬瘟热病毒非典型核衣壳蛋白基因序列分析原核表达

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检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体间接ELISA的建立

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河北农业大学学报 2005年第1期28卷 79-82页

作者：袁万哲何孔旺陆承平河北农业大学动物科技学院河北保定071001 江苏省农业科学院农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为了评价仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41 四价亚单位疫苗的免疫效果,利用纯化粘附素为包被抗原,建立了检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体的间接ELISA。初步确定了各种反应条件: K88、K99、987P、F41粘附素抗原最适包被浓度依次为1∶400... 详细信息

为了评价仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41 四价亚单位疫苗的免疫效果,利用纯化粘附素为包被抗原,建立了检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体的间接ELISA。初步确定了各种反应条件: K88、K99、987P、F41粘附素抗原最适包被浓度依次为1∶400、1∶80、1∶40、1∶40,相应粘附素抗体最佳稀释度依次为1∶400、1∶200、1∶200、1∶200。经交叉试验、阻断试验和重复试验证实,本方法具有良好的特异性和重复性。

关键词：间接ELISA 抗体粘附素产肠毒素性大肠杆菌

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白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因真核双表达质粒的构建

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南京农业大学学报 2009年第1期32卷 100-104页

作者：潘群兴何孔旺温立斌郭容利黄克和江苏省农业科学院兽医研究所／农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2)的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA)等方法验证基因的表达情况。结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2... 详细信息

应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2)的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA)等方法验证基因的表达情况。结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基因的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2。

关键词：猪圆环病毒2型 ORF2基因 IL-2基因 DNA疫苗

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定量产肠毒素性大肠杆菌黏附素抗原反向间接血凝试验的建立

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中国兽医杂志 2007年第2期43卷 7-10页

作者：袁万哲何孔旺陆承平孙继国河北农业大学动物科技学院河北保定071001 江苏省农业科学院农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

利用黏附素单因子血清IgG致敏绵羊红细胞,建立了定量产肠毒素性大肠杆菌黏附素抗原的反向间接血凝试验。该试验所用K88、K99、987P和F41单因子血清IgG致敏红细胞的最佳浓度依次为30μg/ml、56μg/ml、28μg/ml和100μg/ml。经交叉试验... 详细信息

利用黏附素单因子血清IgG致敏绵羊红细胞,建立了定量产肠毒素性大肠杆菌黏附素抗原的反向间接血凝试验。该试验所用K88、K99、987P和F41单因子血清IgG致敏红细胞的最佳浓度依次为30μg/ml、56μg/ml、28μg/ml和100μg/ml。经交叉试验、抑制试验和敏感性试验证实,该试验具有很高的特异性和敏感性,可用于生物制品中黏附素含量的定量。

关键词：反向间接血凝试验黏附素产肠毒素性大肠杆菌

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PCR方法检测2型猪链球菌2种毒力因子

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2002年第3期23卷 1-4页

作者：何孔旺陆承平倪艳秀王继春姚火春南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农科院农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室江苏南京210014

根据 2型猪链球菌毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)与细胞外蛋白因子 (EF)基因 (mrp与 epf)序列 ,分别设计、合成一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)方法。该方法扩增出 2型菌株的 mrp大小为 885 bp,epf为 62 6bp,而对马链球菌兽疫亚种 (C... 详细信息

根据 2型猪链球菌毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)与细胞外蛋白因子 (EF)基因 (mrp与 epf)序列 ,分别设计、合成一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)方法。该方法扩增出 2型菌株的 mrp大小为 885 bp,epf为 62 6bp,而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等 PCR均未扩增出任何条带。用 Xba 和 H ae 分别酶切 PCR扩增产物 ,均获得与预计一致的酶切图谱 ,PCR扩增产物测序结果显示 :其基因序列分别与 Gen Bank上公布的mrp全基因第 5 0 0～ 1 3 1 5位碱基及 epf全基因第 2 441～ 3 0 2 8碱基对一致。PCR检测的敏感度可达 1 0 0个细菌。用建立的 PCR对从病猪体内分离的菌株进行检测 ,检测的 1 5株 2型分离株中有 1 3株 mrp与 epf均为阳性 ,为典型的高毒力表现型菌株 (mrp+ epf+ ) ,1株为 mrp+ epf- ,1株为 mrp- epf- 。

关键词： PCR方法猪链球菌毒力因子聚合酶链反应

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检测987p^+肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立

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中国兽医科技 2002年第1期32卷 3-5页

作者：华荣虹张书霞何孔旺倪艳秀杨宗照南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室江苏南京210014 杭州市畜牧兽医总站浙江杭州310020

以 98 7p菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了 1对可扩增 45 9bp目的片段的引物 ,建立了检测肠毒素性大肠埃希氏菌 987p菌毛基因的PCR方法。该方法对K 88+ (+为菌毛阳性 )、K 99+ 、F 41+ 参考菌株和链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌... 详细信息

以 98 7p菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了 1对可扩增 45 9bp目的片段的引物 ,建立了检测肠毒素性大肠埃希氏菌 987p菌毛基因的PCR方法。该方法对K 88+ (+为菌毛阳性 )、K 99+ 、F 41+ 参考菌株和链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该方法的敏感度可达 10 2 CFU ,对 2 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,有 1株为阳性 ,与血清学检测的结果一致。结果表明 ,此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床

关键词：肠毒素性大肠埃希氏菌菌毛基因 PCR 检测方法粘附性菌毛腹泻仔猪

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