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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会

作者：夏向荣黄灿平姜平王先炜李玉峰南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前危害养猪业的重要病原之一。由于PRRS尚无有效的治疗方法,主要依靠综合性防治,因此,及时确诊该病具有重要的理论与实践意义。PRRSV不同株存在抗原性差异,而其核衣壳蛋白(N蛋白)在大多分离株中具有... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前危害养猪业的重要病原之一。由于PRRS尚无有效的治疗方法,主要依靠综合性防治,因此,及时确诊该病具有重要的理论与实践意义。PRRSV不同株存在抗原性差异,而其核衣壳蛋白(N蛋白)在大多分离株中具有共同的抗原决定簇,猪感染PRRSV后

关键词：猪伪狂犬病 ELISA 酶标二抗家畜传染病学猪大肠杆菌病标准化研究检测方法

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鸭瘟病毒gB蛋白N端抗原域的高效表达及其免疫特性

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农业生物技术学报 2008年第5期16卷 743-747页

作者：潘华奇曹瑞兵王楠刘丽刘磊胡江春陈溥言王书锦中国科学院沈阳应用生态研究所南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室甘肃农业大学动物医学院

在分析鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)gB蛋白抗原性的基础上,设计1对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因,克隆到表达载体pET32a中,构建了原核表达质粒pET-gB1。将pET-gB1转化到感受态大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中... 详细信息

在分析鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)gB蛋白抗原性的基础上,设计1对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因,克隆到表达载体pET32a中,构建了原核表达质粒pET-gB1。将pET-gB1转化到感受态大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约42.4kD的目的蛋白以包涵体形式表达。Western blot分析发现,表达产物与抗鸭瘟的鼠阳性血清发生特异性反应。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中,利用His·Bind试剂盒获得纯化的蛋白,将纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠,间接ELISA法测得抗体的效价,MTT法检测免疫小鼠的T淋巴细胞增殖反应能力。结果说明,该融合蛋白能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫。

关键词：鸭瘟病毒糖蛋白B 原核表达抗原域免疫原性

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串联表达PRRSV GP3、GP4与GP5重组腺病毒的构建与免疫特性研究

串联表达PRRSV GP3、GP4与GP5重组腺病毒的构建与免疫特性研究

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中国畜牧兽医学会2006学术年会

作者：蒋文明姜平李玉峰王先炜南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室

利用PER扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的GV3与GP4基因,按正确的读码框与GP5基因单独或同时串联, 成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-GP3-GP5、pShuttle-CMV-GP4-GP5、pShuttle-CMV-GP3-GP4-GP5。同时构建了单个基因的穿梭载体。PCR、测序鉴... 详细信息

利用PER扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的GV3与GP4基因,按正确的读码框与GP5基因单独或同时串联, 成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-GP3-GP5、pShuttle-CMV-GP4-GP5、pShuttle-CMV-GP3-GP4-GP5。同时构建了单个基因的穿梭载体。PCR、测序鉴定正确。Pme Ⅰ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组, 产生重组腺病毒DNA。将重组腺病毒DNA经Pac Ⅰ线性化后脂质体法转染HEK-293A细胞,包装成完整的腺病毒。IFA 和Western blot可以检测到GP3、GP4、GP5单个基因的重组腺病毒以及GP3与GP5、GP4与GP5、GP3、GP4与GP5串联的重组腺病毒构建成功,可以正确的表达目的蛋白。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,结果表明三种方式串联的重组腺病毒比单基因重组腺病毒可以诱导产生更强的体液免疫应答(ELISA抗体和中和抗体)和细胞免疫应答(淋巴细胞增殖和CTL反应)。这说明三种方式串联的重组腺病毒具有更好的免疫原性,为下一步猪体免疫试验奠定了基础。

关键词： PRRSV GP3 GP4 GP5 重组腺病毒体液免疫细胞免疫

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PRRSV抗体竞争ELISA检测方法的建立与标准化研究

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畜牧与兽医 2005年第11期37卷 7-10页

作者：夏向荣柏庆荣柏坤桃黄灿平姜平南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095 江苏省高邮市畜牧兽医站江苏高邮225600

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)基因的原核表达产物重组N蛋白为包被抗原,利用兔抗重组N蛋白血清和PRRS猪血清竞争该抗原,建立间接竞争ELISA方法检测PRRS抗体。经研究确定重组N蛋白的包被浓度为0·3μg/mL,检测... 详细信息

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)基因的原核表达产物重组N蛋白为包被抗原,利用兔抗重组N蛋白血清和PRRS猪血清竞争该抗原,建立间接竞争ELISA方法检测PRRS抗体。经研究确定重组N蛋白的包被浓度为0·3μg/mL,检测血清不用稀释,兔抗重组N蛋白血清的工作浓度为1∶3000,酶标抗体的工作浓度为1∶10000,包被液为0·05mol/L、pH9·6的碳酸盐缓冲液。该方法特异性强,稳定性和重复性好,整个检测过程可在3h内完成。以IDEXX试剂盒的检测结果为参照标准,该方法的敏感性为79·76%,特异性为90·9%,符合率为83·59%。将该方法按试剂盒要求标准化,4℃放置5个月,检测效果不变。

关键词： PRRSV 抗体诊断竞争ELISA

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用免疫金技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒

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畜牧与兽医 2001年第2期33卷 1-2页

作者：李军林继煌姜平何孔旺倪艳秀还红华江苏省农科院农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室南京农业大学动物医学院江苏南京210095

用胶体金标记提纯后的兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)IgG ,建立了一种以微孔滤膜为固相载体 ,以红色胶体金为标记物的检测PRRSV的斑点免疫金渗滤法 (DIGFA)。特异性阻断试验与交叉试验证明DIGFA检测PRRSV有较高的特异性。检测 1 5... 详细信息

用胶体金标记提纯后的兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)IgG ,建立了一种以微孔滤膜为固相载体 ,以红色胶体金为标记物的检测PRRSV的斑点免疫金渗滤法 (DIGFA)。特异性阻断试验与交叉试验证明DIGFA检测PRRSV有较高的特异性。检测 1 5份临床样本 ,其中 3份DIG FA及细胞培养均为阳性。

关键词：猪繁殖呼吸综合征斑点免疫金渗滤试验繁殖-呼吸综合征病毒检测

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副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立

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畜牧与兽医 2006年第3期38卷 5-7页

作者：王艳夏万田柏坤桃尹秀凤姜平南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095 江苏省高邮市畜牧兽医站江苏高邮225600

采用福尔马林灭活的副猪嗜血杆菌全菌体作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。经试验确定副猪嗜血杆菌全菌体的包被浓度为2·24×107CFU/孔、检测血清为1∶200稀释,同时确立了间接ELISA的最佳反应条件。该... 详细信息

采用福尔马林灭活的副猪嗜血杆菌全菌体作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。经试验确定副猪嗜血杆菌全菌体的包被浓度为2·24×107CFU/孔、检测血清为1∶200稀释,同时确立了间接ELISA的最佳反应条件。该方法有很高的特异性和重复性,14个发病猪场100份血清检测结果Hps抗体阳性检出率为94%,明显高于细菌分离鉴定检测结果。

关键词：副猪嗜血杆菌 ELISA 抗体

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猪链球菌病双重PCR诊断方法的建立

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中国兽医科学 2007年第8期37卷 700-704页

作者：马清霞何孔旺陆承平南京农业大学动物医学院江苏省农业科学院兽医研究所农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室江苏南京210014

根据猪链球菌2型荚膜多糖和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的保守区序列分别设计了2对简并引物,建立了一种能同时检测猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法。结果显示,该双重PCR能从100个细菌的混合纯培养物中扩增出2条目的片段。而且... 详细信息

根据猪链球菌2型荚膜多糖和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的保守区序列分别设计了2对简并引物,建立了一种能同时检测猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法。结果显示,该双重PCR能从100个细菌的混合纯培养物中扩增出2条目的片段。而且可以直接从病料组织中检测到相应的病原菌。用建立的双重PCR方法和细菌分离培养法平行检测人工感染的组织病料,PCR方法与细菌培养法的阳性检出率基本一致,但PCR方法的特异性好、敏感性高,简便易行,可以用于猪链球菌病的流行病学调查和实验室的快速鉴别诊断。

关键词：猪链球菌2型马链球菌兽疫亚种双重PCR

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表达MDV-gB基因的重组鸡痘病毒免疫效果观察

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中国兽医科技 2002年第9期32卷 21-22页

作者：丁巧玲陈溥言王鹏雁佛山科技学院动物医学系广东南海528231 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095 石河子大学动物科技学院新疆石河子830023

将马立克氏病病毒 (MDV ) gB基因插入鸡痘病毒中 ,构建了含有MDV gB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV ) ,用rFPV、火鸡疱疹病毒 (HVT)冻干疫苗、rFPV +HVT二联疫苗分别免疫 1日龄AA肉用雏鸡 ,8日龄攻毒后观察免疫保护效果。结果表明 ,3种疫苗... 详细信息

将马立克氏病病毒 (MDV ) gB基因插入鸡痘病毒中 ,构建了含有MDV gB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV ) ,用rFPV、火鸡疱疹病毒 (HVT)冻干疫苗、rFPV +HVT二联疫苗分别免疫 1日龄AA肉用雏鸡 ,8日龄攻毒后观察免疫保护效果。结果表明 ,3种疫苗均诱导了免疫应答 ,免疫保护率分别为 69%、69%和 85 %。该重组病毒疫苗的免疫效果与HVT疫苗的免疫效果相当 ,二者联用具有免疫协同作用。

关键词：重组鸡痘病毒免疫效果鸡马立克氏病病毒 gB基因免疫保护率

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仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗的研制 Ⅳ.疫苗生产与免疫效力试验

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中国兽医学报 2007年第6期27卷 818-820,861页

作者：袁万哲何孔旺陆承平河北农业大学动物科技学院保定河北071001 江苏省农业科学院农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室南京江苏210014 南京农业大学动物医学院南京江苏210095

选用4株带有K88、K99、987P、F41粘附素抗原的产肠毒素性大肠杆菌,分别接种于BBL、Minca、Slanetz和Minca培养基进行培养,将培养物加热提取粘附素抗原后,加入油佐剂制成四价亚单位疫苗。经成品检验合格后分别免疫小鼠和怀孕母猪,同时监... 详细信息

选用4株带有K88、K99、987P、F41粘附素抗原的产肠毒素性大肠杆菌,分别接种于BBL、Minca、Slanetz和Minca培养基进行培养,将培养物加热提取粘附素抗原后,加入油佐剂制成四价亚单位疫苗。经成品检验合格后分别免疫小鼠和怀孕母猪,同时监测怀孕母猪抗体。最后1次免疫后15 d,分别用同源ETEC确定的攻毒剂量攻击。结果显示,经2次免疫后,K88、K99、987P、F41对小鼠的免疫保护率与1次免疫没有显著差异(P>0.05);对仔猪,1次免疫跟2次免疫均可显著地降低腹泻指数(P<0.05),2次免疫与1次免疫没有显著差异(P>0.05)。怀孕母猪免疫1周后(产前23 d)抗体开始上升,第2周(产前16 d)达到高峰。2次免疫后抗体迅速回升,第4周(产前2 d)达到最高峰,产后2 d抗体大幅度下跌,几近免疫前水平。二免母猪所产仔猪发病率明显低于一免母猪(P<0.05)。攻毒保护试验和抗体消长规律的结果表明,制备的仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗具有良好的免疫原性,能有效预防仔猪大肠杆菌病的发生。

关键词：产肠毒素性大肠杆菌疫苗效力检验腹泻指数

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重组酵母鸡α干扰素的研制及其抗病毒活性测定

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中国免疫学杂志 2007年第9期23卷 829-832页

作者：蔡梅红曹瑞兵王传友盛洁潘璐琳陈溥言江苏大学食品与生物工程学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京农业大学动物医学院中国人民解放军73081部队农副业基地

目的:通过酵母真核表达系统获得鸡α干扰素,并鉴定其抗病毒生物活性。方法:以ConA刺激4～10小时后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆出鸡α干扰素成熟蛋白基因,通过EcoRI和XbaI两个酶切位点使该基因插入酵母表达载... 详细信息

目的:通过酵母真核表达系统获得鸡α干扰素,并鉴定其抗病毒生物活性。方法:以ConA刺激4～10小时后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆出鸡α干扰素成熟蛋白基因,通过EcoRI和XbaI两个酶切位点使该基因插入酵母表达载体(pPICZa-A),并把线性化该重组酵母鸡α干扰素载体,通过电转化使鸡α干扰素基因整和到酵母(X33)基因组上,利用微量病变抑制法测定表达的鸡α干扰素的抗病毒活性。结果:实验结果表明重组酵母鸡α干扰素活性单位为10×48U/ml,具有较好的抗病毒效果。结论:实验研究结果表明重组酵母鸡α干扰素具有较好的抗病毒能力。

关键词：鸡α干扰素分泌表达抗病毒

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