检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2008年第9期24卷 1573-1581页

作者：李祥健张建武吕健余丹丹姚火春袁世山中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室上海200241 南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

高致病性猪蓝耳病近年来在我国广泛流行,目前尚无高效疫苗用于该病的防制。本研究以PRRSV弱毒感染性克隆-pAPRRS作为主要骨架,将高致病性猪蓝耳病病毒江西分离株(JX143)的主要结构蛋白基因(ORF4-7)以及3′UTR区域替换入pAPPRS相应编码区... 详细信息

高致病性猪蓝耳病近年来在我国广泛流行,目前尚无高效疫苗用于该病的防制。本研究以PRRSV弱毒感染性克隆-pAPRRS作为主要骨架,将高致病性猪蓝耳病病毒江西分离株(JX143)的主要结构蛋白基因(ORF4-7)以及3′UTR区域替换入pAPPRS相应编码区域,构建了pSX12(ORF4-7-3′UTR)、p5NX12(ORF5-7-3′UTR)以及p56N12(ORF5-6)三个PRRSV全长嵌合克隆。经DNA转染Marc-145细胞后拯救出嵌合病毒,并对拯救病毒进行了病毒生物学特性的分析;选取拯救病毒v56N12(ORF5-6)和vSX12(ORF4-7-3′UTR)免疫29日龄猪进行免疫原性试验,结果表明,以v56N12免疫后抗体水平相对较低,故免疫原性相对较差;而vSX12病毒免疫后14d血清ELISA抗体达到阳性值(IDEXXELISA值s/p≥0.4),免疫后28d中和抗体效价从原来的1:5以下上升到1:15以上,说明vSX12具有良好的免疫原性并可进行免疫监测;免疫后28d以强毒JX143株攻毒,结果vSX12免疫组未见发病,而未免疫攻毒对照组全部发病并有1头死亡,vSX12免疫猪攻毒后病毒血症持续6d后消失,而对照组攻毒后至少持续13d,说明vSX12可对高致病性猪蓝耳病提供有效的免疫保护。本研究构建的三个嵌合病毒为开发同时抗经典和变异株PRRSV感染的二价疫苗,以及探寻高致病性猪蓝耳病病毒的毒力因子奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征高致病性猪蓝耳病感染性克隆嵌合病毒候选疫苗

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志贺毒素2型噬菌体ΦMin27的stx2基因突变株构建及其感染特性

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微生物学报 2008年第9期48卷 1227-1233页

作者：苏良科严亚贤陆承平上海交通大学农业与生物学院上海市兽医生物技术重点实验室上海200240 南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

【目的】通过构建一株stx2基因突变的志贺毒素2型噬菌体,来观察它对不同血清型大肠杆菌的感染特性。【方法】利用λ噬菌体的Red重组系统,将氯霉素抗性基因(cat)插入到大肠杆菌O157:H7Min27株的stx2基因中,获得O157:H7Min27的突变菌株Min... 详细信息

【目的】通过构建一株stx2基因突变的志贺毒素2型噬菌体,来观察它对不同血清型大肠杆菌的感染特性。【方法】利用λ噬菌体的Red重组系统,将氯霉素抗性基因(cat)插入到大肠杆菌O157:H7Min27株的stx2基因中,获得O157:H7Min27的突变菌株Min27(△stx∷cat)。用丝裂霉素对该突变菌株进行诱导,结合抗性标记和PCR方法筛选出一株突变的志贺毒素2型噬菌体,命名为ΦMin27(△stx∷cat)。采用双层琼脂平板法和氯霉素抗性筛选的方法,观察ΦMin27(△stx∷cat)感染21株不同血清型大肠杆菌后的裂解和溶原转换情况。【结果】2株血清型分别为O60和O138的大肠杆菌可以被ΦMin27(△stx∷cat)溶原感染,表现出对氯霉素的抗性,但没有形成噬菌斑,而大肠杆菌MG1655株既可以被溶原又可以被裂解。溶原的菌株经丝裂霉素诱导后,能释放出感染性的ΦMin27(△stx∷cat)颗粒,并对大肠杆菌MC1061进行裂解形成噬菌斑。【结论】ΦMin27(△stx∷cat)可以感染和溶原特定的大肠杆菌,且溶原菌株能释放出原感染性的噬菌体,显示出ΦMin27噬菌体具有携带外源基因在若干不同血清型的大肠杆菌间水平转移的能力,为进一步研究Stx噬菌体的感染机理和志贺毒素表达调控奠定了基础。

关键词：大肠杆菌O157:H7 Stx2噬菌体 ΦMin27(△stx∷cat) 感染特性

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家蝇防御素抗菌肽Des-hf突变体的抑菌活性

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农业生物技术学报 2008年第1期16卷 85-89页

作者：李鹏仇妍虹李腩郑其升曹瑞兵周斌张秋伟陈溥言南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室河北农业大学动物科技学院山西农业大学动科院

采用PCR定点突变技术,将家蝇(Musca domestica)防御素抗菌肽成熟肽段的基因(des-hf)第32位氨基酸残基由甘氨酸(G)突变为带正电荷的精氨酸(R),构成第一个突变体des-hf-MU1;采用同样的方法在des-hf基因的C端加上6个带有正电荷的赖氨酸(K)... 详细信息

采用PCR定点突变技术,将家蝇(Musca domestica)防御素抗菌肽成熟肽段的基因(des-hf)第32位氨基酸残基由甘氨酸(G)突变为带正电荷的精氨酸(R),构成第一个突变体des-hf-MU1;采用同样的方法在des-hf基因的C端加上6个带有正电荷的赖氨酸(K),构成第2个突变体des-hf-MU2。采用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统对上述2个突变体进行表达。抗菌特性表明,抗菌肽突变体对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有较好的抑菌活性。琼脂孔扩散法检测des-hf-MU1和des-hf-MU2的抑菌效价比des-hf分别提高了2.4和8.0倍。酸稳定性试验显示,抗菌肽突变体在pH值为5～6时活性最高,热稳定性试验显示des-hf-MU1和des-hf-MU2100℃加热10min后仍具有抑菌活性。显示了两抗菌肽突变体具有良好的应用前景。

关键词：家蝇防御素抗菌肽突变体抑菌活性防御素

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鸭瘟病毒gB蛋白N端抗原域的高效表达及其免疫特性

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农业生物技术学报 2008年第5期16卷 743-747页

作者：潘华奇曹瑞兵王楠刘丽刘磊胡江春陈溥言王书锦中国科学院沈阳应用生态研究所南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室甘肃农业大学动物医学院

在分析鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)gB蛋白抗原性的基础上,设计1对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因,克隆到表达载体pET32a中,构建了原核表达质粒pET-gB1。将pET-gB1转化到感受态大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中... 详细信息

在分析鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)gB蛋白抗原性的基础上,设计1对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因,克隆到表达载体pET32a中,构建了原核表达质粒pET-gB1。将pET-gB1转化到感受态大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约42.4kD的目的蛋白以包涵体形式表达。Western blot分析发现,表达产物与抗鸭瘟的鼠阳性血清发生特异性反应。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中,利用His·Bind试剂盒获得纯化的蛋白,将纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠,间接ELISA法测得抗体的效价,MTT法检测免疫小鼠的T淋巴细胞增殖反应能力。结果说明,该融合蛋白能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫。

关键词：鸭瘟病毒糖蛋白B 原核表达抗原域免疫原性

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猪圆环病毒病流行动态与防制研究进展

猪圆环病毒病流行动态与防制研究进展

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第二届南京农业大学畜牧兽医学术年会

作者：姜平南京农业大学动物医学院，农业部动物疫病诊断与免疫重点开发实验室，江苏　南京　210095

猪圆环病毒病(PCVD)是由猪圆环病毒2型引起的猪的一种新的传染病，其临床表现多种多样，主要特征为体质下降、生长发育不良、消瘦、贫血、黄胆、呼吸困难、渗出性皮炎、腹泻、母猪繁殖障碍。本文介绍了猪圆环病毒病的国内外流行动态、... 详细信息

猪圆环病毒病(PCVD)是由猪圆环病毒2型引起的猪的一种新的传染病，其临床表现多种多样，主要特征为体质下降、生长发育不良、消瘦、贫血、黄胆、呼吸困难、渗出性皮炎、腹泻、母猪繁殖障碍。本文介绍了猪圆环病毒病的国内外流行动态、病原特性、诊断和预防措施。

关键词：猪圆环病毒病流行动态病原特性预防措施

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含LoxP位点和EGFP的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体的构建

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甘肃农业大学学报 2008年第2期43卷 8-12页

作者：潘华奇刘磊曹瑞兵魏凡华袁立科李娟孙海亮潘光炎甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095 宁夏大学农学院动物科学系宁夏银川750021

提取鸭瘟病毒(DPV)疫苗株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank已发表的DPV UL区UL24、UL23、UL22基因序列,选择保守序列设计了两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R),L包括部分UL24、部分T... 详细信息

提取鸭瘟病毒(DPV)疫苗株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank已发表的DPV UL区UL24、UL23、UL22基因序列,选择保守序列设计了两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R),L包括部分UL24、部分TK,R包括部分TK及部分UL22,L和R的拼接片段中TK基因内部缺失468个核苷酸.将L片段和R片段克隆于pBluescript M13-载体上,获得了pSKLR;再将含2个LoxP位点的表达绿色荧光蛋白的基因表达盒插入pSKLR的L片段和R片段之间构成转移载体pSKLR-EGEP-LoxP.大量提取pSKLR-EGEP-LoxP质粒,用脂质体转染鸭胚成纤维细胞,24 h后蛋白被正确表达,表明含LoxP位点的表达EGFP的鸭瘟病毒TK基因缺失的重组转移载体被成功构建.

关键词：鸭瘟病毒 EGFP Cre/LoxP TK基因转移载体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合感染性克隆的构建和应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合感染性克隆的构建和应用

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会

作者：李祥健张建武吕健余丹丹姚火春袁世山中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室

高致病性猪蓝耳病近年来在我国广泛流行,目前尚无高效疫苗用于该病的防制。本研究以PRRSV弱毒感染性克隆-pAPRRS作为主要骨架,将高致病性猪蓝耳病病毒江西分离株(JX143)的主要结构蛋白基因(ORF4-7)以及3'UTR区域替换入pAPPRS相应编... 详细信息

高致病性猪蓝耳病近年来在我国广泛流行,目前尚无高效疫苗用于该病的防制。本研究以PRRSV弱毒感染性克隆-pAPRRS作为主要骨架,将高致病性猪蓝耳病病毒江西分离株(JX143)的主要结构蛋白基因(ORF4-7)以及3'UTR区域替换入pAPPRS相应编码区域,构建了pSX12(ORF4-7-3'UTR)、p5NX12(ORF5-7-3'UTR)以及p56N12 (ORF5-6)三个PRRSV全长嵌合克隆。经DNA转染Marc-145细胞后拯救出嵌合病毒,并对拯救病毒进行了病毒生物学特性的分析;选取拯救病毒v56N12(ORF5-6)和vSX12(ORF4-7-3UTR)免疫29日龄猪进行免疫原性试验,结果表明,以v56N12免疫后抗体水平相对较低,故免疫原性相对较差;而vSX12病毒免疫后14d血清ELISA抗体达到阳性值(IDEXX ELISA值s/p≥0.4),免疫后28d中和抗体效价从原来的1:5以下达到1:15以上,说明vSX12具有良好的免疫原性并可进行免疫监测;免疫后28d以强毒Jx143株攻毒,结果vSX12免疫组未见发病,而未免疫攻毒对照组全部发病并有1头死亡,vSX12免疫猪攻毒后病毒血症持续6d后消失,而对照组攻毒后至少持续13d,说明vSX12可对高致病性猪蓝耳病提供有效的免疫保护。本研究构建的三个嵌合病毒为开发同时抗经典和变异株PRRSV感染的二价疫苗,以及探寻高致病性猪蓝耳病病毒的毒力因子奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征高致病性猪蓝耳病感染性克隆嵌合病毒候选疫苗

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复合抗菌肽PL在毕赤酵母中的分泌表达及其活性研究

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生物工程学报 2007年第3期23卷 418-422页

作者：牛明福李翔曹瑞兵周斌陈德胜陈溥言南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断和免疫重点实验室南京210095 河南新乡医学院基础医学院新乡453003

为了获得抗菌活性较强的抗菌肽,将几种抗菌肽串联起来在毕赤酵母中表达,并比较其与单独抗菌肽的抑菌活性。以GenBank中的Protegrin-1(PG-1)、ScorpionDefensin(SD)、Metalnikowin-2A和SheepMyeloidAntibacterialPeptide(SMAP-29)(序列号分别为AAB27599,AAAB27538、P80409和P49928)成熟肽段作为模板序列,根据巴斯德毕赤氏酵母(***)偏好密码子,设计并人工合成复合抗菌肽pl基因,同时用SOE法获得ScorpionDefensin的基因,分别克隆到pPICZαA载体中,转化***受体菌X-33,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,复合抗菌肽PL及SD均获得表达。体外抑菌试验检测复合抗菌肽PL与单独的蝎子防御素SD的热稳定性、酸稳定性、最低抑菌浓度等,结果显示复合抗菌肽PL及SD具有很强的热酸稳定性,而针对不同的细菌,复合抗菌肽则表现出了强于单独的SD的活性,特别是对大肠杆菌。上述结果说明了该复合抗菌肽具有很好的开发前景。

关键词：复合抗菌肽PL 蝎子防御素SD 分泌表达热酸稳定性抑菌活性

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共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪γ-干扰素基因的腺病毒载体的构建与鉴定

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中国生物工程杂志 2007年第1期27卷 35-40页

作者：牛明福李翔曹瑞兵郑其升魏建超姬向波李鹏周斌陈溥言南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断和免疫重点实验室南京210095 河南新乡医学院基础医学院新乡453003

利用PCR方法分别扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒全长GP5基因(编码E蛋白),EMCV的核糖体介入位点序列(IRES)及猪γ-干扰素基因全长序列(IFN-γ),序列测定正确后用DNA重组法将三者串联后插入pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP穿梭质粒中,形成的穿梭质... 详细信息

利用PCR方法分别扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒全长GP5基因(编码E蛋白),EMCV的核糖体介入位点序列(IRES)及猪γ-干扰素基因全长序列(IFN-γ),序列测定正确后用DNA重组法将三者串联后插入pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP穿梭质粒中,形成的穿梭质粒plRES-GP5-IFN-γ用PmeI线性化后,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转化感受态大肠埃希氏菌BJ5183,经同源重组,构建成含有GP5基因和IFN-γ基因的重组腺病毒载体,pacI酶切线性化充分暴露反向末端重复序列后,脂质体转染HEK293A细胞,借助GFP的表达可以在转染后的2～3天观察到包装病毒rAdeno-GP5-IFN-γ产生,7～10天出现病毒蚀斑。经PCR法及酶切证实各中间过程载体及最终的包装病毒中携带有目的基因,Western-blot证实两基因在腺病毒中得到了表达。大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便地构建出含有目的基因的腺病毒载体rAdeno-GP5-IFN-γ,重组子能够在HEK293细胞中稳定扩增,病毒包装的成功为进一步研究PRRSVE蛋白的免疫效果及IFN-γ的作用奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因猪γ-干扰素重组腺病毒

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伪狂犬病病毒UL24基因的原核表达及抗UL24蛋白抗体的制备

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2007年第9期35卷 10-14页

作者：于春梅李鹏郑其升李斐苏鑫铭曹瑞兵周斌陈溥言南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095

为了给伪狂犬病病毒(PrV)UL24蛋白的细胞定位和功能研究提供参考依据,据GenBank公布的PrVUL24基因序列(登录号NC006151)设计1对引物,以质粒pUL24-GFP为模板,用PCR方法扩增出部分缺失的基因片段mUL24(modified UL24)。将mUL24片段定向克... 详细信息

为了给伪狂犬病病毒(PrV)UL24蛋白的细胞定位和功能研究提供参考依据,据GenBank公布的PrVUL24基因序列(登录号NC006151)设计1对引物,以质粒pUL24-GFP为模板,用PCR方法扩增出部分缺失的基因片段mUL24(modified UL24)。将mUL24片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达载体pET-UL24。阳性质粒转化宿主菌***21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白(His)6-UL24以包涵体的形式获得表达。用纯化后的pET-UL24融合蛋白免疫家兔,ELISA分析表明,在血清效价达到1∶2 560以上,Western-blot分析制备的抗体可以和pET-UL24表达产物发生反应,具有良好的免疫特异性。

关键词：伪狂犬病毒 UL24基因原核表达抗体制备

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