检索结果-内蒙古大学图书馆

猪细小病毒2型VP蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

中国兽医科学 2015年第2期45卷 118-125页

作者：何玉王广操张梦岩李玉峰白娟姜平王先炜南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095

为了有效监测猪细小病毒2型(PPV2)的抗体水平,选择PPV2VP蛋白主要亲水区及高抗原指数区进行原核表达。以表达的重组tVP蛋白为包被抗原建立了检测PPV2抗体的间接ELISA。优化后的反应条件为:抗原包被浓度为0.8μg/mL,血清的最佳稀释度为1... 详细信息

为了有效监测猪细小病毒2型(PPV2)的抗体水平,选择PPV2VP蛋白主要亲水区及高抗原指数区进行原核表达。以表达的重组tVP蛋白为包被抗原建立了检测PPV2抗体的间接ELISA。优化后的反应条件为:抗原包被浓度为0.8μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的工作浓度为1∶20 000,检测的临界值为0.400 5(D450nm≥0.400 5判定为阳性)。特异性试验证明,与猪细小病毒1型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒O型血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。应用此方法对采自江苏省的480份临床血清样本进行了检测,PPV2抗体阳性率为31%。试验结果表明,tVP蛋白能很好地获得表达,以此蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床血清PPV2抗体的检测。

关键词：猪细小病毒2型重组截短的VP蛋白原核表达间接酶联免疫吸附试验

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脑心肌炎病毒灭活疫苗佐剂的筛选及其效力评价

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中国兽医学报 2015年第2期35卷 242-246页

作者：蒋康富白娟李玉峰王先炜姜平南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095

采用ISA201、ISA15A、GEL、CP940和1313佐剂分别与脑心肌炎病毒(EMCV)灭活抗原混合,配制成5种疫苗,采用BALB/c小鼠进行免疫保护试验。结果显示,5种佐剂疫苗对小鼠无明显不良反应,均能够诱导机体产生抗EMCV特异性ELISA抗体、中和抗体和... 详细信息

采用ISA201、ISA15A、GEL、CP940和1313佐剂分别与脑心肌炎病毒(EMCV)灭活抗原混合,配制成5种疫苗,采用BALB/c小鼠进行免疫保护试验。结果显示,5种佐剂疫苗对小鼠无明显不良反应,均能够诱导机体产生抗EMCV特异性ELISA抗体、中和抗体和淋巴细胞增殖反应,其中ISA15A、ISA201和GEL佐剂组抗体水平和淋巴细胞增殖转化刺激指数都显著高于抗原对照组(P<0.01),而且,ISA15A佐剂组免疫应答反应高于ISA201和GEL佐剂组(P>0.05)。采用EMCV强毒攻击,ISA15A、ISA201和GEL佐剂组免疫保护率均达90%,表明用ISA15A、ISA201和GEL这3种佐剂配制的EMCV灭活疫苗具有较高的免疫疫保护效力,为该病灭活疫苗研制奠定基础。

关键词：脑心肌炎病毒灭活疫苗免疫效力

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致病性副溶血弧菌三重PCR检测方法的建立和评价

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中国动物传染病学报 2015年第6期23卷 48-55页

作者：何再平王权陈永军刘迎春韩先干王少辉白雪瑞刘永杰蒋蔚中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

根据副溶血弧菌种特异性基因(tox R)、耐热直接溶血素基因(tdh)和相对耐热直接溶血素基因(trh)为靶基因分别设计引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了检测含有溶血素毒力基因的致病性副溶血弧菌的多重PCR方法。3对引物能分别特异性... 详细信息

根据副溶血弧菌种特异性基因(tox R)、耐热直接溶血素基因(tdh)和相对耐热直接溶血素基因(trh)为靶基因分别设计引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了检测含有溶血素毒力基因的致病性副溶血弧菌的多重PCR方法。3对引物能分别特异性地扩增出368、269、486 bp的目的片段。副溶血弧菌均能扩增出tox R基因,不含溶血素基因的菌株(tdh-/trh-)仅扩增出1条目的片段,而含不同溶血素基因的致病性副溶血弧菌则分别扩增出2条(tdh+/trh-或tdh-/trh+)和3条(tdh+/trh+)特异性条带。检测其他非副溶血弧菌的供试菌,则不出现任何扩增条带。人工模拟样品检测结果显示对致病性副溶血弧菌的最低检测浓度为103CFU/m L。结果表明该多重PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏性,对检测致病性副溶血弧菌有重要意义。

关键词：副溶血弧菌种特异性基因溶血素基因多重PCR 检测

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副溶血弧菌TDH蛋白高效表达、免疫原性分析及初步应用

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中国动物传染病学报 2015年第6期23卷 56-62页

作者：李欣彤陈永军刘迎春白雪瑞王少辉韩先干刘永杰王权蒋蔚中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

副溶血弧菌是引起细菌性食物中毒的主要食源性致病菌,耐热直接溶血毒素(theromostable direct hemolysin,TDH)是其公认的主要致病因子。本研究根据已发表基因序列(Gen Bank登录号:M10069)设计引物,以副溶血弧菌SHJLA株基因组DNA为模板,... 详细信息

副溶血弧菌是引起细菌性食物中毒的主要食源性致病菌,耐热直接溶血毒素(theromostable direct hemolysin,TDH)是其公认的主要致病因子。本研究根据已发表基因序列(Gen Bank登录号:M10069)设计引物,以副溶血弧菌SHJLA株基因组DNA为模板,扩增编码TDH蛋白的基因,克隆至表达质粒p ET28a(+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序,结果表明插入片段长度为576 bp。重组原核表达质粒p ET28a-tdh转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导可表达分子量约为27 k Da的融合蛋白,主要以包涵体形式表达。对包涵体进行复性,Western blot分析表明经过复性后的重组蛋白能够被感染副溶血弧菌SHJLA株的小鼠血清识别。重组蛋白免疫家兔,ELISA检测多抗血清效价在1:256 000以上。将该多抗初步应用于斑点-ELISA(DotELISA)方法的建立,TDH阳性的致病性副溶血弧菌检测到阳性斑点,而TDH阴性的副溶血弧菌及其他细菌未检测到特异性斑点。本研究可为深入研究TDH的蛋白功能,建立致病性副溶血弧菌免疫学快速诊断方法以及保护性疫苗的研制提供研究基础。

关键词：副溶血弧菌直接溶血素蛋白表达斑点-ELISA

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脑心肌炎病毒灭活疫苗佐剂的筛选及其效力评价

脑心肌炎病毒灭活疫苗佐剂的筛选及其效力评价

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第九届南京农业大学畜牧兽医学术年会暨生猪标准化与生产效益持续提升研讨会

作者：蒋康富白娟李玉峰王先炜姜平南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095

采用ISA201、ISA15A、GEL、CP940和1313佐剂分别与脑心肌炎病毒(EMCV)灭活抗原混合,配制成5种疫苗,采用BALB/c小鼠进行免疫保护试验.结果显示,5种佐剂疫苗对小鼠无明显不良反应,均能够诱导机体产生抗EMCV特异性EL1SA抗体、中和抗体和淋... 详细信息

采用ISA201、ISA15A、GEL、CP940和1313佐剂分别与脑心肌炎病毒(EMCV)灭活抗原混合,配制成5种疫苗,采用BALB/c小鼠进行免疫保护试验.结果显示,5种佐剂疫苗对小鼠无明显不良反应,均能够诱导机体产生抗EMCV特异性EL1SA抗体、中和抗体和淋巴细胞增殖反应,其中ISA15A、ISA201和GEL佐剂组抗体水平和淋巴细胞增殖转化刺激指数都显著高于抗原对照组(P＜0.01).而且,ISA15A佐剂组免疫应答反应高于ISA201和GEL佐剂组(P＞0.05).采用EMCV强毒攻击,ISA15A、ISA201和GEL佐剂组免疫保护率均达90％,表明用ISA15A、ISA201和GEL这3种佐剂配制的EMCV灭活疫苗具有较高的免疫保护效力,为该病灭活疫苗研制奠定基础.

关键词：猪脑心肌炎病毒灭活疫苗免疫保护效力

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猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7间接ELISA抗体检测方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7间接ELISA抗体检测方法的建立

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上海市畜牧兽医学会2015年学术年会

作者：战晓燕李玉峰姜平上海农林职业技术学院上海201699 南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏210095

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)重组非结构蛋白NSP7作为包被抗原,优化反应条件,建立了用于检测PRRSV抗体的间接ELISA方法.抗原最适包被浓度为0.4 μ g/ml,37℃包被2h,封闭剂为1％BSA,37℃封闭3h,血清最适稀释度为1∶100,37℃作用1h...

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)重组非结构蛋白NSP7作为包被抗原,优化反应条件,建立了用于检测PRRSV抗体的间接ELISA方法.抗原最适包被浓度为0.4 μ g/ml,37℃包被2h,封闭剂为1％BSA,37℃封闭3h,血清最适稀释度为1∶100,37℃作用1h,酶标SPA最佳稀释度1∶20,000,37℃作用30min,底物最佳反应时间为37℃ 10min.设定阴、阳性对照,采用S/P比值作为判定标准,若S/P≥0.4,判为阳性;若S/P＜0.3,判为阴性.该法与圆环病毒2型等其它6种常见猪病原抗体没有交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数分别小于9％和8％,表明该法具有较好的特异性和重复性.与IDEXX公司的PRRSV抗体检测试剂盒比较,其相对敏感性、特异性分别为90.0％、95.0％,符合率达92.0％,检测结果无显著性差异.

关键词：

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Stx2噬菌体溶原对大肠杆菌运动性及其相关基因表达的影响

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微生物学报 2014年第7期54卷 737-745页

作者：曹冬梅吉文汇严亚贤王恒安孙建和陆承平上海交通大学农业与生物学院、上海市兽医生物技术重点实验室上海200240 南京农业大学动物医学院、农业部动物疫病诊断与免疫开放重点实验室江苏南京210095

【目的】通过基因缺失和噬菌体溶原转换研究大肠杆菌运动相关基因flhDC、fliA、fliD和fliE对Stx2噬菌体ΦMin27溶原菌的影响。【方法】本实验利用Red重组酶系统,构建了大肠杆菌MG1655的缺失株MG1655△flhDC、MG1655△fliA、MG1655△fliD... 详细信息

【目的】通过基因缺失和噬菌体溶原转换研究大肠杆菌运动相关基因flhDC、fliA、fliD和fliE对Stx2噬菌体ΦMin27溶原菌的影响。【方法】本实验利用Red重组酶系统,构建了大肠杆菌MG1655的缺失株MG1655△flhDC、MG1655△fliA、MG1655△fliD及MG1655△fliE,并将flhDC片段、fliA片段、fliD片段和fliE片段连接pUC18后分别转化相应的突变株,得到相应的互补菌株。通过Stx2噬菌体ΦMin27的感染获得各缺失株的溶原株MG1655△flhDCФMin27、MG1655△fliAФMin27、MG1655△fliDФMin27及MG1655△fliEФMin27。随后测定了野生株、缺失株、互补株和溶原株的运动能力,并通过荧光定量PCR分析了flhDC缺失前后野生株和溶原株其他运动相关基因表达量的变化。【结果】Stx2噬菌体ФMin27溶原感染可促进MG1655的fliA和fliD基因的表达,增强宿主菌MG1655的运动特性;MG1655在flhDC基因缺失的状态下,fliA和fliD基因的表达同步出现上调,但运动性未发生变化,而MG1655△flhDC溶原菌丧失了运动特性,基因转录水平检测发现MG1655△flhDCФMin27与MG1655△flhDC相比,fliA和fliD基因的表达同步出现显著下调,而对fliE基因的表达几乎没有影响。fliA、fliD和fliE单个基因的缺失对大肠杆菌MG1655和Stx2噬菌体ΦMin27溶原菌的运动性几乎没有影响。【结论】提示fliA和fliD基因共同参与了鞭毛运动的调控,flhDC基因可影响噬菌体溶原菌株的运动性,为进一步研究噬菌体溶原与宿主基因之间的相互调节作用提供理论依据。

关键词：大肠杆菌 Stx2噬菌体溶原菌 flhDC 运动性

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鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的原核表达和单克隆抗体制备

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中国动物传染病学报 2014年第2期22卷 58-64页

作者：侯湾湾韩先干王少辉王小兰岳嘉蘋曹守林范红结于圣青南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛... 详细信息

本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得2株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G2B6和1G2F10。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价达到1:102 400。Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。

关键词：鸭疫里默氏杆菌 GroEL蛋白单克隆抗体

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单增李斯特菌溶源性噬菌体的诱导及鉴定

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上海交通大学学报（农业科学版） 2014年第5期32卷 39-43页

作者：安慧婷刘瑾王娟姚火春王恒安上海市兽医生物技术重点实验室上海交通大学农业与生物学院上海200240 农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京农业大学动物医学院南京210095

利用丝裂霉素C诱导获得单增李斯特菌溶源性噬菌体,并确定其核酸类型。PCR及其扩增产物的序列测定检测原噬菌体,透射电子显微镜观察丝裂霉素C诱导获得的溶源性噬菌体颗粒,DNase I、RNase A和绿豆核酸酶分别消化噬菌体基因组,确定噬菌体... 详细信息

利用丝裂霉素C诱导获得单增李斯特菌溶源性噬菌体,并确定其核酸类型。PCR及其扩增产物的序列测定检测原噬菌体,透射电子显微镜观察丝裂霉素C诱导获得的溶源性噬菌体颗粒,DNase I、RNase A和绿豆核酸酶分别消化噬菌体基因组,确定噬菌体的核酸类型。结果显示,38株单增李斯特菌分离株中的16株在tRNAArg位点携有原噬菌体,其中1株可诱导出噬菌体颗粒,该噬菌体为长尾噬菌体,核酸为dsDNA。噬菌体的成功诱导为噬菌体及其功能基因的开发利用奠定了基础。

关键词：单增李斯特菌噬菌体核酸类型

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猪痢疾诊断技术研究进展

猪痢疾诊断技术研究进展

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第七届南京农业大学畜牧兽医学术年会

作者：周斌南京农业大学动物医学院/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095

本文针对猪痢疾疾病的诊断技术研究进展进行了概述。其中包括:细菌学检查（显微镜检查、分离培养、鉴定），血清学检验（琼脂免疫扩散试验，白细胞游走抑制琼脂糖试验等）及PCR检测技术。

关键词：猪痢疾病理诊断技术分析分离培养

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