检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1170-1178页

作者：张宝戈黄雅琴蔡金双朱晨光李玉峰南京农业大学动物医学院农业农村部动物细菌学重点实验室南京210095

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆... 详细信息

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%学调查与临床诊断提供技术支持。

关键词：猪圆环病毒3型 Cap重组蛋白单克隆抗体阻断ELISA

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副猪格拉瑟菌6个候选抗原对小鼠的免疫特性分析

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畜牧兽医学报 2023年第5期54卷 2073-2082页

作者：伭婷杨凯一蔡金双耿琰李玉峰南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室南京210095

旨在获得具有良好免疫效果的候选抗原,本研究原核表达了副猪格拉瑟菌6个具有潜在保护力的蛋白,对小鼠免疫后进行攻毒,以期筛选获得具有免疫保护效果较好的候选抗原,从而为开发具有交叉保护作用的副猪格拉瑟菌亚单位疫苗奠定基础。63只BA... 详细信息

旨在获得具有良好免疫效果的候选抗原,本研究原核表达了副猪格拉瑟菌6个具有潜在保护力的蛋白,对小鼠免疫后进行攻毒,以期筛选获得具有免疫保护效果较好的候选抗原,从而为开发具有交叉保护作用的副猪格拉瑟菌亚单位疫苗奠定基础。63只BALB/c小鼠随机平均分为9组:HPSNAG-1330、CyaY、HPSNAG-0978、HPSNAG-0140、AfuA以及Fe^(3+)ABC-tbp 6个亚单位疫苗组、***-5灭活苗组、攻毒对照组和空白组;亚单位疫苗组每种对应蛋白各免疫50μg·只^(-1),灭活苗组免疫4×10^(9)CFU,一免与二免间隔14 d,二免14 d后攻毒,副猪格拉瑟菌Nakasaki菌株攻毒剂量为1.26×10^(9)CFU。在二免14 d后检测特异性抗体水平、淋巴细胞增殖和IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表达,攻毒后观察小鼠的临床症状并观察肺、脾的组织病理变化。免疫组小鼠均能产生体液免疫反应;淋巴细胞增殖试验显示:除rAfuA外,其它重组蛋白均能刺激灭活苗组中小鼠淋巴细胞显著增殖(P<0.05),而6个重组蛋白对相应的亚单位疫苗组和空白组小鼠淋巴细胞增殖均不显著;同时,CyaY组和HPSNAG-1330组小鼠机体的炎性反应和脾、肺的损伤程度相对温和,综合评价效果优于灭活苗组。本研究通过小鼠免疫保护试验筛选出CyaY和HPSNAG-1330两个具有免疫保护性的候选抗原,为后续开展多个抗原的联合免疫和猪体试验提供了素材。

关键词：副猪格拉瑟菌亚单位疫苗免疫效果评价

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2021-2022年华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查

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中国兽医科学 2024年第4期54卷 519-525页

作者：张杰张路捷周昊然刘星白娟姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为初步了解我国华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行特点,2021-2022年采集华东地区480份临床疑似PRRSV样品,采用RT-PCR方法检测是否存在PRRSV,统计显示阳性为175份,阳性检出率为38.89%。对来自不同猪场的24个阳性样品的病毒ORF... 详细信息

为初步了解我国华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行特点,2021-2022年采集华东地区480份临床疑似PRRSV样品,采用RT-PCR方法检测是否存在PRRSV,统计显示阳性为175份,阳性检出率为38.89%。对来自不同猪场的24个阳性样品的病毒ORF5基因测序,所有检测的毒株均属美洲型,共可以分为4个亚型,其中11个毒株属于高致病性PRRSV(HP-PRRSV)(Sublineage 8.7);6个毒株属于类NADC30毒株亚型(Sublineage 1.8);4个毒株属于类NADC34亚型(Sublineage 1.5)。病毒GP5蛋白基因测序结果显示,流行毒株GP5蛋白aa3-39及aa185-200两个高变区出现变异。该研究表明我国该地区PRRSV流行毒株存在遗传多样性,基因型复杂,需要引起我们的重视。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5 NADC34 NADC30 遗传变异

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伪狂犬病病毒VHS蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

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畜牧与兽医 2025年第5期57卷 99-106页

作者：赵桐潘梦娇刘克森白娟马梓承刘星南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为制备伪狂犬病病毒(PRV)VHS蛋白单克隆抗体,通过原核表达系统将目的基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),获得pET-32a-VHS重组质粒,成功制备了PRV VHS重组蛋白,将纯化后的蛋白作为免疫原接种BALB/c雌鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和3... 详细信息

为制备伪狂犬病病毒(PRV)VHS蛋白单克隆抗体,通过原核表达系统将目的基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),获得pET-32a-VHS重组质粒,成功制备了PRV VHS重组蛋白,将纯化后的蛋白作为免疫原接种BALB/c雌鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和3轮亚克隆获得了2株PRV VHS蛋白的单克隆抗体,分别命名为1H8和4C3。使用间接ELISA方法检测,2株VHS单抗细胞均能稳定分泌抗体,且腹水抗体效价均达到1∶409 600。1H8和4C3的轻链均属于Kappa型,重链皆为IgG1亚类。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)显示,2株杂交瘤细胞株分泌的单抗均能与PRV病毒蛋白发生特异性反应。通过VHS蛋白的截短表达和Western blot鉴定出1H8单抗可以识别抗原表位^(241)VAPEDVKLKY^(250),单抗4C3可以识别抗原表位^(103)RADGDGAADAPP^(114)。本研究制备出2株VHS的单克隆抗体,鉴定出2个新的抗原表位,为后续研究PRV VHS蛋白功能及其在病毒感染和免疫应答中的作用提供了重要依据。

关键词：伪狂犬病病毒 VHS蛋白单克隆抗体抗原表位

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副猪格拉瑟菌5型细胞致死性膨胀毒素CdtB破坏猪呼吸道上皮屏障的机制

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畜牧兽医学报 2023年第1期54卷 304-316页

作者：陈敏刘明星张鹏云蔺辉星范红结南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室南京210095

旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,... 详细信息

旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,经透射电子显微镜(TEM)观察,OMVs的粒径在100~200 nm,纳米粒子直径分析(NTA)结果显示,样品在100~200 nm处的粒子数目最多。进而用制备的HbpA及OmpP2多克隆抗体对OMVs及不含OMVs的细菌上清进行Western blot验证,证实所提取的样品为外膜囊泡,且进一步结果证明细胞致死性膨胀毒素(CDT)在GPS培养物中主要以OMVs的形式存在。用OMVs或CdtB处理猪气管上皮细胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)36 h,检测STEC中cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表达水平,并用FITC-葡聚糖(FD-4)检测STEC单层细胞的细胞旁通透性。结果发现,OMVs与CdtB处理后凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达水平升高,ZO-1和Occludin的表达水平降低,FD-4渗透率升高,同时,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试验发现,当CdtB与STEC单层细胞共孵育24 h、OMVs与STEC单层细胞共孵育36 h后,STEC存活率显著降低。而Pifithrin-α预处理STEC可抑制OMVs和CdtB引起的细胞凋亡和屏障通透性的增加。另外,用免疫磁珠捕获的方法去除OMVs中的CdtB(OMVs-ΔCdtB),OMVs-ΔCdtB处理STEC 36 h后cleaved-caspase3、ZO-1、Occludin表达水平与对照组相比无显著差异。综上,成功提取并纯化GPS OMVs,且试验证明GPS可通过OMVs转运CdtB诱导STEC凋亡和屏障损伤,为副猪格拉瑟菌突破呼吸道上皮屏障的机制提供新思路。

关键词：副猪格拉瑟菌外膜囊泡细胞致死性膨胀毒素CdtB 猪呼吸道上皮细胞

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Dermcidin促进猪流行性腹泻病毒复制的研究

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畜牧与兽医 2023年第3期55卷 110-118页

作者：王远王先炜南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

猪流行性腹泻病(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性的猪胃肠道疾病,可导致哺乳仔猪产生急性水样腹泻,造成严重的经济损失。为调查抗菌肽Dermcidin(DCD)对PEDV复制的影响,本研究利用Western blot、荧光定量PCR(RT-qPCR... 详细信息

猪流行性腹泻病(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性的猪胃肠道疾病,可导致哺乳仔猪产生急性水样腹泻,造成严重的经济损失。为调查抗菌肽Dermcidin(DCD)对PEDV复制的影响,本研究利用Western blot、荧光定量PCR(RT-qPCR)以及测定病毒半数组织细胞感染量TCID_(50)等方法,通过检测在DCD的作用下PEDV在细胞中的基因转录、蛋白表达和病毒滴度的水平,并利用Western blot检测信号通路中蛋白表达水平,探究其作用的分子机制。研究表明,DCD能够参与PEDV感染;DCD过表达促进了PEDV在Vero细胞和LLC-PK1细胞中的复制,而敲低DCD抑制了PEDV复制;DCD通过诱导PTEN表达来抑制Akt-mTOR-p70S6K通路相关蛋白位点的磷酸化,从而介导自噬促进PEDV复制。研究DCD对PEDV复制的作用机制,对今后PEDV防治工作有重要参考意义。

关键词：猪流行性腹泻病毒 Dermcidin(DCD) 病毒复制自噬

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G3BP1^(-/-)293T细胞系的构建及其影响塞内卡病毒A复制的研究

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中国兽医科学 2023年第8期53卷 977-982页

作者：高雁怩郭承意姜晓琳赵栩白娟南京农业大学动物医学院、农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定G3BP1敲... 详细信息

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定G3BP1敲除细胞系,CCK-8法检测细胞增殖速度;荧光定量RT-PCR方法检测SVA感染后基因组拷贝数,Western-blot检测病毒蛋白VP1表达水平;间接免疫荧光(IFA)检测敲除G3BP1基因对细胞内应激颗粒形成的影响。结果显示,筛选出1株G3BP1基因缺失5 bp的293T细胞(G3BP1-/-293T),其增殖速度与正常细胞相比未见显著差异;荧光定量RT-PCR结果和Western-blot结果表明,在病毒感染早期,敲除G3BP1基因显著抑制SVA基因组复制和病毒蛋白表达;IFA结果显示,敲除G3BP1基因不会影响其细胞内应激颗粒的形成,表明G3BP1对SVA复制的影响与应激颗粒的形成无关。综上,本研究获得1株G3BP1-/-293T细胞系,该细胞能够在病毒感染早期抑制SVA复制,为进一步研究G3BP1对SVA复制的影响奠定了基础。

关键词： G3BP1基因基因敲除 293T细胞塞内卡病毒A 复制

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纤维二糖利用基因簇对巴氏链球菌生长及毒力的影响

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南京农业大学学报 2024年第5期47卷 923-931页

作者：李鑫椿王硕玥吴宗福南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室/世界动物卫生组织猪链球菌病参考实验室江苏南京210095 广东省养猪与猪病防控技术研究企业重点实验室广东广州511400

[目的]本研究旨在明确纤维二糖利用基因簇对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[方法]以肺炎链球菌基因组中纤维二糖利用基因簇为参考,同源性比对分析猪源巴氏链球菌WUSP067中纤维二糖利用基因簇,通过荧光定量PCR(RT-qPCR)、RT-PCR、缺失株... 详细信息

[目的]本研究旨在明确纤维二糖利用基因簇对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[方法]以肺炎链球菌基因组中纤维二糖利用基因簇为参考,同源性比对分析猪源巴氏链球菌WUSP067中纤维二糖利用基因簇,通过荧光定量PCR(RT-qPCR)、RT-PCR、缺失株构建、不同条件下的生长曲线测定、小鼠毒力试验等评价其对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[结果]巴氏链球菌WUSP067基因组中存在2个潜在的纤维二糖利用相关基因簇(cellobiose locus, CL),将其分别命名为CL1和CL2,它们均包括编码磷酸转移酶系统和β-葡萄糖苷酶的基因。RT-qPCR结果显示,与添加10 g·L^(-1)葡萄糖的DMEM培养基相比,在添加10 g·L^(-1)纤维二糖的DMEM培养基中,CL1中的BglP1_(wp)和BglA_(wp)基因表达量无显著差异,而CL2中celA_(wp)和celB_(wp)基因表达极显著上调(P<0.000 1),分别上调49倍和33倍,提示其参与利用纤维二糖。选择CL2深入研究,RT-PCR结果显示,该基因簇由2个操纵子组成。构建编码β-葡萄糖苷酶的celA_(wp)基因缺失株,生长曲线分析表明,野生株和celA_(wp)基因缺失(ΔcelA_(wp))株在THB、DMEM+10 g·L^(-1)葡萄糖条件下生长情况无明显差异,但在DMEM+10 g·L^(-1)纤维二糖条件下,野生株能以纤维二糖为唯一碳源生长,而ΔcelA_(wp)表现出明显的生长缺陷,生长12 h时D_(600)仍低于0.5。以断奶仔鼠为感染模型,比较野生株和ΔcelA_(wp)株的毒力,每鼠攻毒剂量为3×10^(8) CFU,野生株攻毒组小鼠3日内全部死亡,而ΔcelA株攻毒组的小鼠死亡趋势较缓,14 d后存活率为20%(P<0.05)。[结论]猪源巴氏链球菌WUSP067能以纤维二糖为唯一碳源生长,CL2是纤维二糖利用相关基因簇,其中celA_(wp)基因不仅促进该菌利用纤维二糖,而且还影响该菌的毒力,在巴氏链球菌致病过程中发挥作用。

关键词：巴氏链球菌纤维二糖生长毒力

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伪狂犬病病毒TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪毒力稳定性检测

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畜牧与兽医 2023年第8期55卷 51-56页

作者：姜辰龙马梓承吕林刘星白娟孙杨杨姜平南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京京210095

旨在明确伪狂犬病病毒(PRV)TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪的安全性。试验选择21~28日龄PRV阴性健康仔猪,通过病毒接种感染试验,观察ZJ01R在仔猪体内的分布规律及不同代次病毒对仔猪致病性。试验结果显示,仔猪肌肉注射ZJ01R后无明显临... 详细信息

旨在明确伪狂犬病病毒(PRV)TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪的安全性。试验选择21~28日龄PRV阴性健康仔猪,通过病毒接种感染试验,观察ZJ01R在仔猪体内的分布规律及不同代次病毒对仔猪致病性。试验结果显示,仔猪肌肉注射ZJ01R后无明显临床症状,鼻腔排毒3~6 d,免疫后7、14、21 d,猪脑组织检测到PRV,其他组织均无病毒。仔猪滴鼻和肌肉注射F5、F30和F35代次ZJ01R病毒液,体温正常,无明显临床症状和病理变化,无病毒血症,鼻腔排毒时间仅为6 d;仔猪接种后7和14 d,肝脏和肺脏组织病毒检测均阴性,脑组织病毒核酸阳性;感染仔猪血清PRV gB ELISA抗体阳性,gE ELISA抗体阴性,表明ZJ01R毒株35代内对仔猪无临床致病作用,病毒毒力稳定性较好。

关键词：伪狂犬病毒 TK/gE/gI基因缺失毒力稳定性

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胸膜肺炎放线杆菌RTX毒素抗原优势决定簇的筛选和融合表达

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畜牧与兽医 2023年第5期55卷 87-94页

作者：耿琰蔡金双伭婷李玉峰南京农业大学动物医学院/农业农村部细菌学重点实验室江苏南京210095

为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的诊断方法,本研究在对APP的RTX毒素(ApxⅠ~Ⅲ)生物学信息分析的基础上,以APP血清5型和8型的DNA为模板对ApxⅠ~Ⅲ分段扩增后进行截短表达,获得12个... 详细信息

为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的诊断方法,本研究在对APP的RTX毒素(ApxⅠ~Ⅲ)生物学信息分析的基础上,以APP血清5型和8型的DNA为模板对ApxⅠ~Ⅲ分段扩增后进行截短表达,获得12个截短表达蛋白。利用Western blot对12个表达蛋白进行抗原性分析,确定ApxⅠ~Ⅲ的优势抗原决定簇分别为蛋白AⅠ2、AⅡ3和AⅢ2。以蛋白AⅡ3、AⅢ2、AⅠ2的顺序排列并在蛋白间加入GPGPG氨基酸序列,无缝克隆3个蛋白片段基因,通过原核表达获得融合蛋白A231。该蛋白可与临床APP阳性猪血清特异性结合,具有良好的免疫反应性。该研究的成功开展可为研制具有交叉保护力的亚单位疫苗及建立配套ELISA检测方法奠定基础。

关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 Apx毒素抗原决定区免疫原性

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