检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2018年第8期49卷 1720-1726页

作者：沈懿娟周妮妮张健淞王美芬李玉峰姜平南京农业大学动物医学院农业部细菌学重点开放实验室南京210095

本研究旨在探讨猪肺泡巨噬细胞传代细胞系3D4/21中转化生长因子β1(TGF-β1)表达和纤连蛋白(Fn)/α5整合素与副猪嗜血杆菌侵入的关系。通过吸附/侵入试验选择副猪嗜血杆菌最佳吸附/侵入条件;运用荧光定量PCR和ELISA方法检测副猪嗜血杆... 详细信息

本研究旨在探讨猪肺泡巨噬细胞传代细胞系3D4/21中转化生长因子β1(TGF-β1)表达和纤连蛋白(Fn)/α5整合素与副猪嗜血杆菌侵入的关系。通过吸附/侵入试验选择副猪嗜血杆菌最佳吸附/侵入条件;运用荧光定量PCR和ELISA方法检测副猪嗜血杆菌感染细胞后对TGF-β1表达的影响;用TGF-β1预处理3D4/21细胞后,用CFU检测TGF-β1表达对副猪嗜血杆菌侵入的影响;用流式细胞术检测副猪嗜血杆菌感染细胞后Fn/α5整合素表达的变化;用特异的小干扰RNA(siRNA)片段干扰Fn/α5整合素表达水平后,研究其与副猪嗜血杆菌对3D4/21吸附/侵入的影响。结果显示,副猪嗜血杆菌感染细胞后会导致TGF-β1表达增加;用重组TGF-β1预处理3D4/21细胞可以显著提高副猪嗜血杆菌的侵入水平;流式细胞术检测显示,重组TGF-β1和副猪嗜血杆菌分别处理3D4/21细胞可以增加Fn和α5整合素的表达;siRNA干扰3D4/21细胞中Fn和α5整合素的表达,细菌侵入数显著降低;然而,只有当α5整合素被干扰时,副猪嗜血杆菌的吸附数量下降。这些结果表明,TGF-β1和Fn/α5整合素的表达促进了副猪嗜血杆菌对3D4/21细胞的侵入,并在此过程中发挥重要作用。

关键词：副猪嗜血杆菌纤连蛋白(Fn) α5整合素 TGF-β1 siRNA

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巴氏杆菌toxA基因的原核表达及生物学特性研究

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中国兽医科学 2018年第8期48卷 991-997页

作者：张健淞夏雨婷沈懿娟梁中洋李玉峰南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点开放实验室

为了探讨多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素（PMT）对真核细胞的致病机制,将编码PMT的tox A基因以及其N端tox N（1~1461 bp）和C端tox C（2 958~3 858 bp）分别克隆到原核表达载体p ET-32a中进行蛋白表达。3个重组蛋白在大肠杆菌中均以可溶性... 详细信息

为了探讨多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素（PMT）对真核细胞的致病机制,将编码PMT的tox A基因以及其N端tox N（1~1461 bp）和C端tox C（2 958~3 858 bp）分别克隆到原核表达载体p ET-32a中进行蛋白表达。3个重组蛋白在大肠杆菌中均以可溶性形式表达,其分子质量大小分别为176 ku、88 ku和67 ku,均能与His单克隆抗体发生特异性免疫反应。体外细胞毒性试验和豚鼠皮肤坏死试验均表明,r PMT与天然PMT具有相同的生物学功能。此外,以原核表达蛋白r PMT-N和r PMT-C分别制备的鼠多抗为一抗,对转染表达N端和C端真核质粒的Vero细胞进行IFA和Western-blot检测。结果表明,2种蛋白特异性良好,制备的多克隆抗体免疫反应条带单一。该研究的成功开展将为后续探究PMT细胞内作用机制提供可靠的生物材料。

关键词：产毒素巴氏杆菌多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素生物学活性截短表达多克隆抗体

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猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用

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中国兽医科学 2014年第10期44卷 1022-1028页

作者：翟淑燕陈兴慧白娟王先炜姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价... 详细信息

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白中和活性单克隆抗体夹心ELISA

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猪巨细胞病毒gB基因的原核表达与间接ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2013年第1期35卷 40-43页

作者：朱月华刘捷白娟宋艳华王先炜姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

猪巨细胞病毒(PCMV)是引起新生仔猪死亡、鼻炎、肺炎和生长速度减缓的重要病原之一,我国尚无有效的诊断方法。为建立检测PCMV的ELISA方法,本研究以重组PCMV囊膜糖蛋白B(gB蛋白)为包被抗原,优化反应条件:抗原包被量0.4μg/mL,待检血清稀... 详细信息

猪巨细胞病毒(PCMV)是引起新生仔猪死亡、鼻炎、肺炎和生长速度减缓的重要病原之一,我国尚无有效的诊断方法。为建立检测PCMV的ELISA方法,本研究以重组PCMV囊膜糖蛋白B(gB蛋白)为包被抗原,优化反应条件:抗原包被量0.4μg/mL,待检血清稀释度1∶100,37℃包被2 h后4℃过夜,5%脱脂乳37℃封闭2 h,二抗1∶10 000稀释,37℃作用2 h,抗体临界值为S/P≥0.354判为阳性,S/P≤0.295判为阴性,介于二者之间为可疑,建立了PCMV抗体间接ELISA检测方法。与猪瘟、猪伪狂犬病、猪附红细胞体病、副猪嗜血杆菌及猪圆环病毒2型等血清抗体无交叉反应,批间和批内重复性较好,对江苏省259份仔猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,从而为PCMV检测和流行病学调查提供了有效方法。

关键词：猪巨细胞病毒重组囊膜糖蛋白B 原核表达间接ELISA

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猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测与ORF3基因分子流行病学调查

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中国预防兽医学报 2013年第7期35卷 555-558,561页

作者：董彦鹏白娟范宝超李玉峰姜平南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为调查乳仔猪腹泻引起疫情的病原,本研究自2011年2月至2012年3月收集华东地区47个规模猪场共153份腹泻病料样品,采用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV),并进行ORF3基因序列分析。结果显示:26个猪场的88份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到5... 详细信息

为调查乳仔猪腹泻引起疫情的病原,本研究自2011年2月至2012年3月收集华东地区47个规模猪场共153份腹泻病料样品,采用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV),并进行ORF3基因序列分析。结果显示:26个猪场的88份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到55.32%,病料阳性率达到57.52%。ORF3基因测序分析显示:11个流行病毒株ORF3全基因序列大小均为675 bp,编码224个氨基酸。11个流行株ORF3基因同源性为95.9%～99.9%,编码氨基酸同源性为96.4%～100%。与欧洲代表性强毒株CV777基因同源性为96.3%～97.0%,编码氨基酸同源性为95.1%～96.4%,与CV777弱毒疫苗株基因同源性为96.8%～97.6%,编码氨基酸同源性为92.3%～93.4%,并且无疫苗病毒株ORF3基因的49个碱基缺失。与韩国病毒株比较,其基因同源性为95.0%～98.5%,编码氨基酸同源性为95.5%～99.6%。基因遗传进化树分析表明,国内外PEDV株可分为4群。我国主要流行病毒株属于第1群,与韩国病毒株亲缘关系较近,而与我国疫苗病毒株存在较大差异。该研究表明,PEDV可能是目前我国仔猪腹泻的主要病原之一,我国PEDV流行病毒株存在明显基因变异。

关键词：猪流行性腹泻病毒 RT-PCR ORF3 流行病学

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副猪嗜血杆菌抗原抗体复合物疫苗对小鼠免疫保护效果的评价

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中国兽医科学 2021年第8期51卷 1015-1022页

作者：祝可心于栋安家慧李玉峰南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

为评价副猪嗜血杆菌标准血清5型菌株(HPS-5)抗原抗体复合物疫苗对小鼠的免疫保护效果,选用40只ICR小鼠,随机分为5组(每组8只),分别设为灭活疫苗组、抗原抗体复合物疫苗组、阴性对照组、攻毒对照组和空白组。将制备的疫苗接种小鼠,在首... 详细信息

为评价副猪嗜血杆菌标准血清5型菌株(HPS-5)抗原抗体复合物疫苗对小鼠的免疫保护效果,选用40只ICR小鼠,随机分为5组(每组8只),分别设为灭活疫苗组、抗原抗体复合物疫苗组、阴性对照组、攻毒对照组和空白组。将制备的疫苗接种小鼠,在首次免疫前、首次免疫2周后、二次免疫2周后分别采集小鼠血清通过间接ELISA方法检测抗体水平。二次免疫2周后,每组随机取3只小鼠分离外周血淋巴细胞并提取总RNA进行反转录,通过SYBR Green实时荧光定量PCR方法检测小鼠细胞因子水平。随后,用HPS-5攻毒,观察7 d,计算免疫保护率。取每组小鼠的肺和脾,制作病理切片后置于显微镜下观察。结果显示:抗原抗体复合物疫苗组刺激小鼠产生的TNF-α、IL-6、IFN-γ细胞因子水平与灭活疫苗组、阴性对照组相当(P>0.05),IL-10细胞因子水平显著低于这两组(P<0.05)。抗原抗体复合物疫苗组的D_(450,IgG2a)/D_(450,IgG1)值(0.76)显著高于灭活疫苗组(0.54)和阴性对照组(0.55)(P<0.01)。灭活疫苗组与抗原抗体复合物疫苗组小鼠的存活率均为60%,病理切片结果显示,抗原抗体复合物疫苗组对肺、脾的保护作用略优于灭活疫苗组。以上结果提示,制备的抗原抗体复合物疫苗可能通过下调Th2型反应从而维持Th1/Th2型免疫反应平衡,同时可以降低小鼠机体的炎性反应,具有较好的免疫保护效果,为研究抗原抗体复合物疫苗预防副猪嗜血杆菌感染奠定了理论基础。

关键词：副猪嗜血杆菌抗原抗体复合物疫苗 Th1/Th2平衡存活率病理变化

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副猪嗜血杆菌4种疑似毒力因子多克隆抗体的制备与鉴定

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畜牧与兽医 2017年第4期49卷 69-73页

作者：夏雨婷张健淞沈懿娟梁中洋李玉峰南京农业大学动物医学院/农业部动物细菌学重点开放实验室江苏南京210095

在利用蛋白质非标记定量技术(Lable-free)分析副猪嗜血杆菌强毒株与无毒株差异蛋白的基础上,筛选出4种疑似毒力因子,通过基因扩增后克隆入原核表达载体p ET-32a,构建重组质粒,转入Rosetta菌株后成功表达了目标蛋白。重组蛋白经亲和层析... 详细信息

在利用蛋白质非标记定量技术(Lable-free)分析副猪嗜血杆菌强毒株与无毒株差异蛋白的基础上,筛选出4种疑似毒力因子,通过基因扩增后克隆入原核表达载体p ET-32a,构建重组质粒,转入Rosetta菌株后成功表达了目标蛋白。重组蛋白经亲和层析纯化后免疫小鼠,制备多克隆抗体,并将其与菌体蛋白进行Western blot验证。结果表明,表达的4种蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体免疫反应条带单一。该研究为从蛋白水平上探讨副猪嗜血杆菌毒力因子的功能奠定了基础。

关键词：副猪嗜血杆菌毒力因子多克隆抗体特性

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日本血吸虫蛋白酶体α2亚基基因的克隆、表达及功能分析

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生物工程学报 2010年第4期26卷 509-516页

作者：洪炀韩宏晓彭金彪李晔石耀军傅志强刘金明李祥瑞林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200241 南京农业大学动物医学院南京210095

26S蛋白酶体是一种能够降解大多数内源性蛋白的多亚基复合物,它的蛋白降解作用能够影响细胞周期、转录控制和其他一些重要的细胞进程。本实验利用PCR技术从日本血吸虫18d童虫中首次扩增到蛋白酶体α2亚基基因(GenBank Accession ***8137... 详细信息

26S蛋白酶体是一种能够降解大多数内源性蛋白的多亚基复合物,它的蛋白降解作用能够影响细胞周期、转录控制和其他一些重要的细胞进程。本实验利用PCR技术从日本血吸虫18d童虫中首次扩增到蛋白酶体α2亚基基因(GenBank Accession ***813725),序列分析表明该基因的开放阅读框(ORF)含708bp,编码235个氨基酸,理论分子量25.84kDa。同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫蛋白酶体α2亚基,命名为SjPSMA2。实时定量PCR分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d和42d虫体中都有表达,7d和23d虫体表达量低于其他几个时期。构建了该基因的原核表达质粒pET28a(+)-SjPSMA2,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白以包涵体形式存在,Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别,并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,诱导产生了较高的特异性抗体水平及12.33%的减虫率和35.23%的肝脏减卵率。SjPSMA2基因及其表达产物的获得,为探索蛋白酶体在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。

关键词：日本血吸虫蛋白酶体α2亚基克隆表达免疫保护

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转基因植物疫苗与转基因植物抗体的研究进展

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中国兽医科技 2003年第9期33卷 29-33页

作者：王宝琴张永光王小龙中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点开放实验室南京农业大学动物医学院江苏南京210095 南京农业大学动物医学院

1989年Curtiss和Cardineau最早将链球菌的突变株表面蛋白抗原(surface protein antigen A, SpaA)基因转入植物进行试验研究，并以专利的形式公开发表。1992年Mason等首先提出了用转基因植物生产医用疫苗的新思路。随后美国有几个研究小... 详细信息

1989年Curtiss和Cardineau最早将链球菌的突变株表面蛋白抗原(surface protein antigen A, SpaA)基因转入植物进行试验研究，并以专利的形式公开发表。1992年Mason等首先提出了用转基因植物生产医用疫苗的新思路。随后美国有几个研究小组和几家生物技术公司利用基因玉米和基因工程的其他植物来制造人的单克隆抗体，希望这种称为“魔弹”的单抗能治疗癌症、阻止传染病传播、用作避孕，甚至防止蛀牙。近几年，植物作为生物外源蛋白的天然生物反应器(natural biore-actor)生产可食性疫苗和植物抗体的研究取得了可喜的进展，该领域的研究成为本世纪又一新热点。笔者就目前转基因植物疫苗研究的基本流程、转基因植物疫苗和植物抗体的研究现状及安全性评价等做一概述。

关键词：转基因植物疫苗转基因植物抗体生物反应器生产流程表达系统安全性转基因植物

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日本血吸虫SjPRMT1基因的克隆、表达及表达产物的免疫保护效果分析

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中国农业科学 2010年第4期43卷 835-841页

作者：韩宏晓彭金彪洪炀王欣之石耀军傅志强刘金明程国锋李祥瑞林矫矫中国农业科学院上海兽医研究所/农业部动物寄生虫学重点开放实验室南京农业大学动物医学院

【目的】克隆和表达日本血吸虫精氨酸甲基转移酶1(SjPRMT1)编码基因cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。【方法】从实验室构建的7d童虫消减cDNA文库中,获得一个ES... 详细信息

【目的】克隆和表达日本血吸虫精氨酸甲基转移酶1(SjPRMT1)编码基因cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。【方法】从实验室构建的7d童虫消减cDNA文库中,获得一个EST序列,经序列测定和生物信息学分析命名为SjPRMT1,以SjcDNA为模板,获得其全长cDNA。荧光实时定量PCR分析该基因在童虫和成虫的表达情况。以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,Western blotting检测重组蛋白的抗原性与免疫原性,利用重组抗原免疫小鼠评估其免疫保护效果。【结果】获得了SjPRMT1编码基因的全长cDNA,开放阅读框为660bp,编码219个氨基酸。荧光实时定量PCR分析该基因在18d童虫高表达,13和23d次之。获得了SjPRMT1重组蛋白,其具有良好的抗原性和免疫原性。在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得35.07%的减虫率和48.66%的肝脏减卵率。【结论】获得了日本血吸虫童虫期高表达的SjPRMT1基因的全长cDNA,成功构建了pET28a(+)-SjPRMT1重组质粒,该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。

关键词：日本血吸虫精氨酸甲基转移酶1 克隆免疫保护小鼠

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