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第三届南京农业大学畜牧兽医学术年会

作者：周斌沈婷张丽颖陈溥言南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京 210095

本试验以乙型脑炎病毒(JEV)弱毒疫苗株(SA14-14-2)作为诊断抗原，对ELISA反应条件进行优化，初步建立了检测猪乙型脑炎病毒血清抗体的间接ELISA 方法。应用该方法对江苏、安徽、山东、浙江四省部分地区收集的1089份血样进行JEV血清流行... 详细信息

本试验以乙型脑炎病毒(JEV)弱毒疫苗株(SA14-14-2)作为诊断抗原，对ELISA反应条件进行优化，初步建立了检测猪乙型脑炎病毒血清抗体的间接ELISA 方法。应用该方法对江苏、安徽、山东、浙江四省部分地区收集的1089份血样进行JEV血清流行病学调查，检测结果表明华东地区JEV抗体阳性率为68.2％，其中种猪和商品猪抗体阳性率分别为82.1％和62.6％。随机抽取135份血样与国产商品化试剂盒进行比较分析,间接ELISA方法的特异性和敏感性分别为92％和96.4％，两种方法的符合率为95.6％。又与JEVNS1蛋白包被建立的ELISA比较，两者的符合率为97.7％。结果显示本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性，适于大规模猪场进行JEV血清流行病学调查。

关键词：猪乙型脑炎病毒间接ELISA法血清流行病学调查弱毒疫苗株诊断抗原检测技术

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江苏1例猪增生性肠炎的PCR鉴定和16S rRNA序列的克隆分析

江苏1例猪增生性肠炎的PCR鉴定和16S rRNA序列的克隆分析

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第三届南京农业大学畜牧兽医学术年会

作者：周斌吴龙成康乐黄艺珠魏建超陈溥言南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京 210095

根据GenBank公布的引起猪增生性肠炎的胞内劳森氏菌的16S rRNA基因的序列，设计并合成一对特异性引物。应用建立的PCR方法从江苏地区疑似患有猪增生性肠炎病猪的8份血便样品中，鉴定出3份样品中存在胞内劳森氏菌。随机选取1份胞内劳森... 详细信息

根据GenBank公布的引起猪增生性肠炎的胞内劳森氏菌的16S rRNA基因的序列，设计并合成一对特异性引物。应用建立的PCR方法从江苏地区疑似患有猪增生性肠炎病猪的8份血便样品中，鉴定出3份样品中存在胞内劳森氏菌。随机选取1份胞内劳森氏菌，命名为江苏株(JSAV-1株)。将其16S rRNA基因克隆到pMD-18 T载体上并进行测序鉴定。应用DNAstar序列分析软件对分离株的16S rRNA基因和其推导氨基酸序列与GenBank中的公布的胞内劳森氏菌的16S rRNA进行序列比对，确定JSAR-1株与GenBank上已公布的胞内劳森氏菌序列同源性为98.9％。结果表明本PCR方法特异性好，为实验室鉴定胞内劳森氏菌提供了一种简单、容易操作的手段。

关键词：猪增生性肠炎胞内劳森氏菌 16S rRNA基因序列分析特异性引物 PCR测序分离鉴定

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猪瘟病毒E2亚单位蛋白与集落刺激因子的融合表达及其免疫效果分析

猪瘟病毒E2亚单位蛋白与集落刺激因子的融合表达及其免疫效果分析

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第三届南京农业大学畜牧兽医学术年会

作者：倪莅文刘珂夏叶罗丽双刘晓东桂红兵庞然周斌陈溥言南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京 210095

优化了工程菌BL21-E2 A/D-GM-CSF(含有783 bp的E2 A/D-GM-CSF融合基因)的原核表达条件，结果表明诱导的最佳时间和诱导剂IPTG的最佳用量分别为4 h和0.8 mmol/L。在此基础上，大量诱导表达融合蛋白后经Ni-IDA蛋白质层析柱纯化，Western-b... 详细信息

优化了工程菌BL21-E2 A/D-GM-CSF(含有783 bp的E2 A/D-GM-CSF融合基因)的原核表达条件，结果表明诱导的最佳时间和诱导剂IPTG的最佳用量分别为4 h和0.8 mmol/L。在此基础上，大量诱导表达融合蛋白后经Ni-IDA蛋白质层析柱纯化，Western-blot鉴定纯化蛋白具有抗原活性。将融合蛋白与福氏佐剂制成亚单位疫苗后免疫试验小鼠，并与E2 A/D蛋白、猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)进行免疫效果比较，结果显示E2 A/D-GM-CSF亚单位疫苗免疫小鼠后能够产生抗猪瘟抗体，并且抗体水平明显高于E2-A/D免疫组和HCLV免疫组。研究表明GM-CSF经融合表达后对E2-A/D蛋白有显著的免疫增强作用。

关键词：猪瘟病毒 E2基因集落刺激因子融合表达免疫增强弱毒疫苗

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猪链球菌2型溶血素重组亚单位疫苗的研制

猪链球菌2型溶血素重组亚单位疫苗的研制

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第三届南京农业大学畜牧兽医学术年会

作者：吉利伟蔡伟刚刘民星杨秋实孔建涛范红结南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京 210095

根据已报道的猪链球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)重要毒力因子溶血素的基因序列，利用DNAstar软件选择抗原性好的一段基因序列，设计并合成该段序列的1对特异性引物。以四川强毒株ZY05719的基因组为模板，PCR扩增后定向克隆至pE... 详细信息

根据已报道的猪链球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)重要毒力因子溶血素的基因序列，利用DNAstar软件选择抗原性好的一段基因序列，设计并合成该段序列的1对特异性引物。以四川强毒株ZY05719的基因组为模板，PCR扩增后定向克隆至pET-32a表达载体中;重组质粒转化至原核系统大肠杆菌B21中，经诱导表达目的蛋白后，利用小鼠进行免疫效果的测定和佐剂筛选，结果使用ISA206佐剂的溶血素(Hly)蛋白亚单位疫苗保护率高。

关键词：猪链球菌2型溶血素蛋白亚单位疫苗免疫效果特异性引物

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动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

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江苏农业学报 2009年第2期25卷 291-295页

作者：夏兴霞刘洁王永山诸玉梅欧阳伟何孔旺张雪寒江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

将*** O157：H7（EHEC—O157：H7）用甲醛灭活、超声破碎，免疫BALB／c小鼠，制备免疫脾细胞；与SP2／0骨髓瘤细胞融合后，获得7株分泌抗*** O157：H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株，分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3，Ig亚... 详细信息

将*** O157：H7（EHEC—O157：H7）用甲醛灭活、超声破碎，免疫BALB／c小鼠，制备免疫脾细胞；与SP2／0骨髓瘤细胞融合后，获得7株分泌抗*** O157：H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株，分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3，Ig亚类分别是IgG2ak、IgG2aK、IgG1K、IgMK、IgMh、IgMK和IgG2aK。用间接ELISA检测，E7和F1细胞培养上清液的效价为1．6×10^3，腹水效价均为1×10^11；C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×10^2，腹水效价均为1×10^3。相加ELISA结果显示，F1、G9和G113株mAbs对应相同的抗原表位，而其它4株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性，7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Westernblotting表明，c3、E7和F13株mAbs在蛋白分子量28×10^3处有特异性条带，而其它4株mAbs则未显示蛋白带。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157∶H7 单克隆抗体(mAb) 生物制剂人兽共患病

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肠出血性大肠杆菌O157：H7 rfbE与fliC基因的表达及鉴定

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江苏农业学报 2009年第3期25卷 568-571页

作者：潘群兴王永山刘洁夏兴霞何孔旺张雪寒江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

利用PCR技术将肠出血性大肠杆菌O157∶H7的rfbE与fliC基因片段分别克隆到pET原核表达系统,在***21(DE3)中表达。结果显示rfbE、fliC以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经His-Bind镍柱纯化目的蛋白,在***21(DE3)中表达的... 详细信息

利用PCR技术将肠出血性大肠杆菌O157∶H7的rfbE与fliC基因片段分别克隆到pET原核表达系统,在***21(DE3)中表达。结果显示rfbE、fliC以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经His-Bind镍柱纯化目的蛋白,在***21(DE3)中表达的rfbE、fliC具有良好的免疫活性。

关键词：肠出血性大肠杆菌 rfbE flic 免疫活性

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兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的制备及鉴定

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中国比较医学杂志 2009年第11期19卷 23-26页

作者：熊富强王芳范志宇恽时锋蔡少平林焱姜平南京军区南京总医院比较医学科南京210002 江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病免疫与诊断重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 南京农业大学动物医学院南京210095

目的建立能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌(Bb)的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后进一步建立该菌的免疫检测技术奠定基础。方法以Bb分离株BLJ05的灭活菌液为免疫原,腹腔免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备Bb单克隆抗体(McAb),用间接... 详细信息

目的建立能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌(Bb)的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后进一步建立该菌的免疫检测技术奠定基础。方法以Bb分离株BLJ05的灭活菌液为免疫原,腹腔免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备Bb单克隆抗体(McAb),用间接ELISA、Western-blot等方法对McAb特性进行鉴定。结果获得两株能稳定分泌抗Bb单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A7D5和D6B2,其小鼠腹水抗体效价分别为1∶409600和1∶102400;且不与兔大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌等兔的常见病原菌反应,特异性强。两株单抗亲和力实验表明A7D5亲和力略高于D6B2。ELISA相加试验表明它们针对相同的抗原表位。结论成功建立了两株能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,效价高、特异性强,为今后建立该菌的免疫检测技术建立奠定了基础。

关键词：兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体

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动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究 Ⅰ.分泌抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究 Ⅰ.分泌抗大肠杆菌...

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中国畜牧兽医学会2009学术年会

作者：夏兴霞刘洁王永山诸玉梅欧阳伟何孔旺张雪寒江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院

引言/目的:食源性病原微生物已成为当今不断增多的食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因。全世界每年至少有200万人死于以感染性腹泻为主的食源性疾病。在食源性病原微生物中,肠出血性大肠杆菌（EHEC）占有重要地位。O157:H7的感染... 详细信息

引言/目的:食源性病原微生物已成为当今不断增多的食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因。全世界每年至少有200万人死于以感染性腹泻为主的食源性疾病。在食源性病原微生物中,肠出血性大肠杆菌（EHEC）占有重要地位。O157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点,已成为全球性的公共卫生问题,获得简便、快速、敏感、实用的O157:H7快速检测方法仍是当前食源性病原微生物防控研究亟需解决的问题。本研究旨在制备抗O157:H7的系列单克隆抗体,为该病原菌的快速检测、抗原结构分析及其致病机理研究提供技术支撑。材料与方法:将*** O157:H7（EHEC-O157:H7）用甲醛灭活超声破碎,免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP/20骨髓瘤细胞融合,建立分泌抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株。结果与讨论:获得七株分泌抗*** O157:H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株,分别命名为2E7、B8、E7、D3、H7、F1和C3,Ig亚类分别是IgG2bκ、IgG2aκ、IgG1κ、IgMκ、IgMκ、IgMκ和IgG2aκ。用间接ELISA检测,E7和F1细胞培养上清液的效价为1.6×10～3,腹水效价均为1×10;C3、2E7、B8、D3和H7细胞培养上清液的效价为1×10～1～2×10～2,腹水效价均为4×10～2～2.5×10～6。相加ELISA结果显示,D3和H7 mAbs对应相同的抗原表位,而其它五株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性,2E7、H7和D3为抗EHEC-O157:H7特异性单克隆抗体,其它四株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Western blotting表明,C3、E7和F1三株mAbs在蛋白分子量28kD处有特异性条带,2E7、D3和H7三株mAbs在蛋白分子量35kD处有特异性条带,而mAbs B8则未显示蛋白带。本研究制备抗O157:H7的系列单克隆抗体,为该病原菌的快速检测、抗原结构分析及其致病机理研究提供技术支撑。同时,实验结果表明大肠杆菌的抗原成分十分复杂,不同血清型甚至同种血清型不同菌株之间存在着大量的共同抗原表位。

关键词：杂交瘤细胞株培养上清液人兽共患细菌病大肠杆菌食源性病原微生物动物源性新制剂单克隆抗体

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动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ.分泌抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ.分泌抗大肠杆菌O...

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：夏兴霞刘洁王永山诸玉梅欧阳伟何孔旺张雪寒江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院

将*** O157:H7（EHEC-O157:H7）用甲醛灭活、超声破碎,免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞;与SP/20骨髓瘤细胞融合后,获得七株分泌抗*** O157:H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株,分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3,Ig亚类分别是IgG2... 详细信息

将*** O157:H7（EHEC-O157:H7）用甲醛灭活、超声破碎,免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞;与SP/20骨髓瘤细胞融合后,获得七株分泌抗*** O157:H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株,分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3,Ig亚类分别是IgG2aκ、IgG2aκ、IgG1κ、IgMκ、IgMλ、IgMκ和IgG2aκ。用间接ELISA检测,E7和F1细胞培养上清液的效价为1.6×10～3,腹水效价均为1×10;C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～1～2×10～2,腹水效价均为1×10～3。相加ELISA结果显示,F1、G9和G11三株mAbs对应相同的抗原表位,而其它4株对应不同的抗原表位.用间接ELISA分析特异性,七株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应.Western blotting表明,C3、E7和F1三株mAbs在蛋白分子量28kD处有特异性条带,而其它四株mAbs则未显示蛋白带。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7 单克隆抗体(mAb) 生物制剂人兽共患病

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重组口蹄疫病毒T细胞表位基因的猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒的构建

重组口蹄疫病毒T细胞表位基因的猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒的构...

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：潘群兴王永山何孔旺欧阳伟王晓丽诸玉梅夏兴霞江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院

将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1上T细胞表位肽(第21～40残基)基因嵌合在PPV VP2的N端,克隆到杆状病毒供体质粒pFastBac HTA中,构建成重组转座载体pFastBac-FMDV VP1:PPV VP2,转化含有穿梭载体Bacmid的*** DH10Bac中,发生转座作用,经蓝白斑筛... 详细信息

将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1上T细胞表位肽(第21～40残基)基因嵌合在PPV VP2的N端,克隆到杆状病毒供体质粒pFastBac HTA中,构建成重组转座载体pFastBac-FMDV VP1:PPV VP2,转化含有穿梭载体Bacmid的*** DH10Bac中,发生转座作用,经蓝白斑筛选获得重组杆状病毒表达质粒rBac-FMDV VP1:PPV VP2,转染昆虫草地夜蛾(Sf9)细胞,并在Sf9中进行了表达。用间接免疫荧光试验(IFA)、Western-blot分析,表达产物具有与PPV VP2天然蛋白相似的生物活性.电镜观察,表达的蛋白能够自我组装成病毒样粒子[PPV:VLP(FMDV)].

关键词：猪细小病毒口蹄疫病毒 VP2 PPV 重组杆状病毒细胞表位病毒样颗粒

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