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中国环境科学 2008年第11期28卷 994-998页

作者：王堃王志春李荣郜彦彦李顺鹏南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室江苏南京210095

从某农药厂废水处理池活性污泥中分离到1株以乐果为唯一碳源生长的细菌,命名为L3.根据其生理生化特征和16S r RNA(GenBank Accession ***004590)基因序列分析,将该菌株初步鉴定为副球菌属(Paracoccus sp.).该菌株能在6h内降解100mg/L的... 详细信息

从某农药厂废水处理池活性污泥中分离到1株以乐果为唯一碳源生长的细菌,命名为L3.根据其生理生化特征和16S r RNA(GenBank Accession ***004590)基因序列分析,将该菌株初步鉴定为副球菌属(Paracoccus sp.).该菌株能在6h内降解100mg/L的乐果至检出限以下.L3降解乐果的最适pH值为7.0,最适温度为35℃.土壤试验表明,L3可在3d内降解250mg/kg乐果至检出限以下.

关键词：乐果生物降解副球菌属

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对硝基苯酚降解菌Pseudomonas ***-7的降解特性及其降解相关基因的克隆

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微生物学报 2008年第11期48卷 1486-1492页

作者：董小军洪青李恋李顺鹏南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

【目的】本研究的目的是分离对硝基苯酚(PNP)降解菌,研究其对PNP的降解特性;克隆其降解相关基因,并进行表达。【方法】本研究通过富集培养法和系列稀释平板涂布法分离PNP降解菌株;采用形态观察、生理生化特征测定和16S rDNA分析对菌株... 详细信息

【目的】本研究的目的是分离对硝基苯酚(PNP)降解菌,研究其对PNP的降解特性;克隆其降解相关基因,并进行表达。【方法】本研究通过富集培养法和系列稀释平板涂布法分离PNP降解菌株;采用形态观察、生理生化特征测定和16S rDNA分析对菌株进行初步鉴定;通过摇瓶试验研究菌株降解特性;利用SEFA-PCR技术克隆降解相关基因,并亚克隆到表达载体pET29a中,构建重组表达质粒pETpnpC,再转入受体菌*** BL21(DE3)中进行诱导表达;通过分光光度法测定表达产物的酶活力。【结果】分离到一株PNP降解菌PDS-7,将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.);该菌株能够以PNP作为唯一碳源、氮源和能源生长,菌株对PNP的最高耐受浓度为80mg/L,最适降解温度为30°C,偏碱性条件有利于菌株对PNP的降解;克隆了PNP降解过程中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因pnpC及马来酰醋酸还原酶基因pnpD(GenBank登陆号EU233791);将pnpC在*** BL21(DE3)菌株进行了诱导表达,表达产物对偏苯三酚和邻苯二酚均有邻位开环活性,比活力分别为0.45U/mg protein和0.37U/mg protein,表明偏苯三酚1,2-双加氧酶基因pnpC得到了活性表达。【结论】分离鉴定了一株PNP降解菌Pseudomonas ***-7,研究了该菌株的降解特性,克隆和表达了降解相关基因。

关键词：对硝基苯酚 Pseudomonas sp.PDS-7 降解特性基因克隆

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遗传稳定型六六六、多菌灵降解基因工程菌构建(英文)

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微生物学报 2008年第1期48卷 45-50页

作者：武俊许敬亮洪青李顺鹏南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

通过PCR的方法从六六六降解菌Sphingomonas ***-A扩增出完整的脱氯化氢酶基因linA。将其克隆到含有mini-Tn5的自杀性质粒pUT4K上,构建成质粒pUT/mini-Tn5-linA.通过三亲杂交,在辅助质粒RK600的帮助下,将pUT/mini-Tn5-linA转移到一株高... 详细信息

通过PCR的方法从六六六降解菌Sphingomonas ***-A扩增出完整的脱氯化氢酶基因linA。将其克隆到含有mini-Tn5的自杀性质粒pUT4K上,构建成质粒pUT/mini-Tn5-linA.通过三亲杂交,在辅助质粒RK600的帮助下,将pUT/mini-Tn5-linA转移到一株高效降解多菌灵菌株Rhodococcus ***-6中。利用mini-Tn5的转座作用将linA基因整合到DJL-6的染色体DNA上,得到工程菌株DJL-6A。该工程菌具有同时降解多菌灵和六六六的功能,且对于初始浓度为0.05μg/mL和5μg/mL的六六六的降解活性与亲本菌株BHC-A相当。在不加任何选择压力的条件下工程菌株进行连续传代,结果证明linA基因可以持续稳定的存在于宿主的染色体DNA上。

关键词：脱氯化氢酶基因linA 转座载体pUT/mini-Tn5 多功能工程菌

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抗甲磺隆假单胞菌的分离及其乙酰乳酸合酶的大小亚基ilvIH基因的克隆和表达

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微生物学报 2008年第11期48卷 1493-1498页

作者：孙笑非黄星陈博李顺鹏何健南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

乙酰乳酸合酶(也称乙酰羟酸合酶acetohydroxyacid synthase,AHAS)是植物、真菌和细菌细胞内支链氨基酸Val、Leu、Ile生物合成过程中关键酶,是乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰氨类的作用靶标。【目... 详细信息

乙酰乳酸合酶(也称乙酰羟酸合酶acetohydroxyacid synthase,AHAS)是植物、真菌和细菌细胞内支链氨基酸Val、Leu、Ile生物合成过程中关键酶,是乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰氨类的作用靶标。【目的】获得抗甲磺隆的乙酰乳酸合酶基因,构建其表达载体,并分析基因中的位点突变与乙酰乳酸合酶对磺酰脲类除草剂抗性产生原因。【方法】从长期使用甲磺隆的土壤中分离到1株抗甲磺隆的菌株Lm10,利用PCR技术从Lm10总DNA中克隆到乙酰乳酸合酶的大小亚基基因ilvIH,对ilvIH氨基酸序列进行比对分析。分别将ilvI和ilvH分别连接到表达载体pET29a(+)多克隆位点,转化大肠杆菌(Escherichia coli)获得转化子BL21(pET-I)和BL21(pET-H),并诱导表达。【结果】菌株Lm10鉴定为假单孢菌(Pseudomonas sp.),对甲磺隆的最高耐受浓度达到14000μmol//L,且对各种乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂具有交叉抗性。Lm10与甲磺隆敏感菌株KT2440的小亚基氨基酸序列完全相同,而大亚基有6个氨基酸位点发生变异。转化子在IPTG诱导下,乙酰乳酸合酶的大小亚基的蛋白成功表达,粗酶液酶活试验结果表明Lm10的ilvI基因表达的乙酰乳酸合酶大亚基对甲磺隆有很强的抗性。【结论】发现菌株Lm10的乙酰乳酸合酶大亚基对甲磺隆有很强的抗性,抗甲磺隆菌株Lm10与敏感菌株KT2440的ilvI有6个氨基酸位点差异,这些位点突变可能是乙酰乳酸合酶对甲磺隆抗性产生的原因。

关键词：乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂除草剂抗性细菌乙酰乳酸合酶 ilvIH

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多功能农药降解基因工程菌株m-CDS-1环境释放安全评价

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微生物学报 2008年第11期48卷 1479-1485页

作者：蒋建东李荣郭新强陈凯李顺鹏南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

【目的】为了评价多功能农药降解基因工程菌株m-CDS-1的环境释放中间试验水平的安全性。【方法】通过农药检测、平板计数、Most probable number-PCR(MPN-PCR)和Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE)等方法在江苏大丰进行了... 详细信息

【目的】为了评价多功能农药降解基因工程菌株m-CDS-1的环境释放中间试验水平的安全性。【方法】通过农药检测、平板计数、Most probable number-PCR(MPN-PCR)和Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE)等方法在江苏大丰进行了工程菌株m-CDS-1田间降解农药效果、定殖动态和对土壤微生物群落结构影响的研究。【结果】投加1.01×107CFU/g干土的工程菌株m-CDS-1在30d时均能完全降解10.71mg/kg的甲基对硫磷和1.29mg/kg的呋喃丹。平板计数表明工程菌株m-CDS-1在土壤中快速下降;MPN-PCR检测结果显示,在4d,15d和30d时,0～10cm混合土壤中该工程菌株的数目分别为2.15±0.98×106CFU/g干土,3.70±4.66×104CFU/g干土和检测不出。工程菌株m-CDS-1的投加不会对土壤可培养三大微生物菌群数量产生显著影响;基于细菌16S rDNA V3区的DGGE分析结果表明,施加农药对细菌菌落结构有显著影响,4d,11d,30d时农药施用区与空白对照区的图谱相似性分别为17.16%,49.81%和75.01%,但到60d时的相似性为98.62%。工程菌株m-CDS-1释放在前期对细菌群落结构有一定影响,4d,11d和30d工程菌株释放区相对于空白的相似性分别为49.57%,38.30%和83.30%。在60d时,空白、施药和施菌小区的图谱相似性都在90%以上。【结论】工程菌株m-CDS-1不仅可同时高效降解甲基对硫磷和呋喃丹,仍保持了实验室内的原有特性,而且不会成为优势菌群长期在土壤环境中存在,也不会对土壤微生物群落结构造成长期影响。

关键词：基因工程菌株m—CDS-1 环境释放安全评价农药降解 Most probable number-PCR(MPN-PCR) Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE)

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中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128自体诱导物合成酶基因的克隆及对生理功能的影响

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微生物学报 2008年第10期48卷 1314-1318页

作者：曲媛杨梦华郑会明钟增涛朱军南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

【目的】从中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128中克隆自体诱导物合成酶基因,从而研究该基因在Sinorhizobium sp.1128群体感应系统中的作用。【方法】利用基因序列同源性比对以及分子克隆的方法,从中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128中克隆... 详细信息

【目的】从中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128中克隆自体诱导物合成酶基因,从而研究该基因在Sinorhizobium sp.1128群体感应系统中的作用。【方法】利用基因序列同源性比对以及分子克隆的方法,从中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128中克隆自体诱导物合成酶基因;利用大肠杆菌异源表达、C18反相薄层层析(TLC)的方法研究该基因的特性;通过中间片段融合的方法缺失该基因,并通过结瘤实验研究该基因对Sinorhizobium sp.1128生理功能的影响。【结果】以草木樨中华根瘤菌Sinorhizobium medicae WSM419自体诱导物合成酶基因Smed_1560序列设计引物,通过PCR扩增在Sinorhizobium sp.1128中寻找到一新的自体诱导物合成基因,命名为traI2。该基因在大肠杆菌Escherichia coli DH5α中表达后能产生两种自体诱导物分子。在Sinorhizobium sp.1128中将该基因缺失,自体诱导物活性下降;回复突变后,自体诱导物活性得到恢复,结瘤实验结果表明该基因能影响根瘤菌的结瘤效率。【结论】中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128群体感应系统是一个复杂的交互系统,它对结瘤的生理功能具有一定的影响。

关键词： Sinorhizobium sp.1128 群体感应自体诱导物合成酶

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耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

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应用与环境生物学报 2008年第4期14卷 534-538页

作者：董晨曹娟张迹沈标南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

高温α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现高温α-淀粉酶基因的高效表达,本研究比较了不同启动子对地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响.分别用强启动子P43和地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启... 详细信息

高温α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现高温α-淀粉酶基因的高效表达,本研究比较了不同启动子对地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的影响.分别用强启动子P43和地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子构建了表达载体pP43NMK-amy和pUBC19-amy,并在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis1A752S中进行表达.结果表明,与地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因自身启动子相比,采用P43启动子的耐高温α-淀粉酶其表达水平提高了8.9倍.而且在枯草芽孢杆菌***1A752S中分泌表达的α-淀粉酶仍具有耐高温的特性,酶反应的最适温度为90℃,表明酶的热稳定性由蛋白质本身的氨基酸序列决定的.

关键词：耐高温α-淀粉酶基因启动子P43 amy启动子高效表达

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降解菌S113对甲磺隆污染土壤生物修复作用的研究

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土壤学报 2008年第1期45卷 150-154页

作者：黄星潘继杰孙纪全孙笑非李顺鹏南京农业大学生命科学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

在室内条件下,研究了降解菌S113(Methylopila sp.)对甲磺隆污染土壤的修复作用。S113能够以甲磺隆为唯一碳源生长,72h对50mgL-1甲磺隆的降解率达98.38%。投加降解菌S113可显著提高土壤中甲磺隆的降解速率。当甲磺隆浓度为10mgkg-1干土,S... 详细信息

在室内条件下,研究了降解菌S113(Methylopila sp.)对甲磺隆污染土壤的修复作用。S113能够以甲磺隆为唯一碳源生长,72h对50mgL-1甲磺隆的降解率达98.38%。投加降解菌S113可显著提高土壤中甲磺隆的降解速率。当甲磺隆浓度为10mgkg-1干土,S113接种量为108个g-1土时,第30天土壤中甲磺隆降解率为76.9%,对照土壤中甲磺隆降解率仅为11.9%。S113降解甲磺隆的速率和接种量呈正相关,当接种量减少为105个g-1干土时,降解菌对甲磺隆的降解作用微弱。在土壤中甲磺隆浓度较低的条件下,S113的降解效果显著,而当土壤中甲磺隆浓度达到50mgkg-1时,甲磺隆降解率仅为39.6%。S113降解土壤中甲磺隆的最适温度为30℃,第30天的降解率可达75.9%。当温度为25℃、20℃时,第30天甲磺隆降解率仅为53.5%和23.9%。S113菌剂灌根,能不同程度地缓解土壤中浓度为40、80μgkg-1的甲磺隆对玉米生长的抑制作用,但当甲磺隆浓度增加到120μgkg-1时,接种S113对药害解除作用不显著。结果表明,人工接种降解菌S113,能有效去除土壤中甲磺隆残留。

关键词： S113 甲磺隆生物修复

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两株抗乙酰羟酸合酶类除草剂克雷伯氏菌的分离及其AHAS基因ilvIH的克隆

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应用与环境生物学报 2008年第5期14卷 663-667页

作者：沈晶晶黄星俞欣妍李顺鹏何健南京农业大学生命科学学院微生物学系/农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

乙酰羟酸合酶(AHAS)是磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、磺酰胺类和嘧啶水杨酸类等乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的作用靶标,获得能抗此类除草剂的AHAS突变基因资源具有非常重要的理论和应用价值.本文从长期使用磺酰脲类除草剂的农田土... 详细信息

乙酰羟酸合酶(AHAS)是磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、磺酰胺类和嘧啶水杨酸类等乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的作用靶标,获得能抗此类除草剂的AHAS突变基因资源具有非常重要的理论和应用价值.本文从长期使用磺酰脲类除草剂的农田土壤中分离到2株抗性细菌HR9和HR11,根据其表型特征、生理生化特性和16SrDNA序列系统发育分析,初步鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.).菌株HR9和HR11对甲磺隆的最高耐受浓度分别达到9600μmol/L和8200μmol/L,且对各种乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂具有交叉抗性.利用PCR技术从HR9、HR11和实验室保存的一株除草剂敏感型克雷伯氏菌LB-2的总DNA中克隆到编码AHAS的基因ilvIH,其中ilvI编码大亚基即催化亚基,ilvH编码小亚基即调节亚基.比对结果表明,菌株HR11与菌株HR9的ilvI有6个位点的氨基酸存在差异,HR9、HR11与LB-2的ilvI各有20和16个位点的氨基酸存在差异.

关键词：乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂除草剂抗性细菌乙酰羟酸合酶 ilvIH

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氯嘧磺隆降解菌株LW-3的分离及生物学特性研究

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微生物学通报 2008年第12期35卷 1899-1904页

作者：王哲孙纪全马吉平黄星李顺鹏南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京210095

从长期受氯嘧磺隆污染的土壤中分离到一株氯嘧磺隆高效降解菌株,命名为LW-3,菌株LW-3可以氯嘧磺隆为唯一氮源生长,接种量为2%时,50mg/L氯嘧磺隆经过7d,降解率达70%~80%。生理生化实验和16SrDNA序列同源性分析,将菌株LW-3归属于假单胞菌... 详细信息

从长期受氯嘧磺隆污染的土壤中分离到一株氯嘧磺隆高效降解菌株,命名为LW-3,菌株LW-3可以氯嘧磺隆为唯一氮源生长,接种量为2%时,50mg/L氯嘧磺隆经过7d,降解率达70%~80%。生理生化实验和16SrDNA序列同源性分析,将菌株LW-3归属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.);菌株的适宜降解条件为;温度30°C^35°C,pH6.5~7.2,pH对菌株LW-3降解氯嘧磺隆有明显地影响。

关键词：氯嘧磺隆微生物降解假单胞菌属生物学特性

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