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中国鹅掌楸纤维素合酶的CRISPR/Cas9基因敲除系统的gRNA表达载体构建

分子植物育种 2017年第6期15卷 2195-2199页

作者：徐惠芳金磊磊徐璇许梦璐张芳超郑晨陈金慧南京林业大学林学院林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037 南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京210037

CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用。... 详细信息

CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用。本研究以中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)为研究对象,首次构建了具有表达中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)gRNA(guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,以LcCESA1基因外显子5'端的第一个外显子区域的GN19NGG序列设计gRNA引物;以p201N-Cas9为载体,Gibson Assembly誖Master Mix为连接酶,通过Gibson Assembly连接技术,将CESA1-gRNA连入p201N-Cas9中,获得p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体。根据载体中插入序列,设计了两对检测引物,经PCR鉴定,均获得了相应大小的序列;测序分析进一步证实确认gRNA已经完整准确地连入载体。p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体能对CESA1基因进行定向编辑,对后续研究鹅掌楸纤维素合酶的基因功能具有重要意义。

关键词： CRISPR/Cas9系统中国鹅掌楸 gRNA 载体构建

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CRISPR/Cas技术及其作用机理

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分子植物育种 2022年第7期20卷 2310-2319页

作者：毛金燕翟惠王洁侯静南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037 南京林业大学林学院南方现代林业协同创新中心南京210037

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated)系统是一种原核生物的免疫系统,能够抵御外来病毒、质粒等遗传元件的入侵,为自身提供了获得性免疫保护机制。该系统具有操作简单、高效等优点... 详细信息

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated)系统是一种原核生物的免疫系统,能够抵御外来病毒、质粒等遗传元件的入侵,为自身提供了获得性免疫保护机制。该系统具有操作简单、高效等优点,通过改造使其成为了锌指核酸酶(ZFNs)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术之后的第三代定点编辑技术。目前,Cas9、Cas12、Cas13、Cas14等Cas蛋白相继出现,这些CRISPR/Cas系统在RNA的指导下,可对靶向的双链DNA、单链RNA和单链DNA进行编辑,在基因敲除或替换、转录调控、表观遗传调控、荧光成像及分子检测等领域具有广阔的应用前景。本研究将对CRISPR/Cas系统的来源、结构及其作用机理进行介绍,以期为CRISPR/Cas系统的应用研究提供一些有益参考。

关键词： CRISPR/Cas 定点编辑双链DNA 单链RNA 单链DNA

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植物RNA-介导的表观跨代遗传

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分子植物育种 2019年第9期17卷 2850-2854页

作者：甄艳殷梓苡施季森南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京210037 南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037

环境胁迫反应的跨代遗传研究与日俱增。其中跨代表观遗传是DNA遗传状态的改变可传给下一代,但DNA序列没有改变。植物遗传信息的表观跨代传递可以依赖RNA的RNA聚合酶扩增sRNA (small RNA)的信息进行传递。植物体内存在着一类sRNAs可以调... 详细信息

环境胁迫反应的跨代遗传研究与日俱增。其中跨代表观遗传是DNA遗传状态的改变可传给下一代,但DNA序列没有改变。植物遗传信息的表观跨代传递可以依赖RNA的RNA聚合酶扩增sRNA (small RNA)的信息进行传递。植物体内存在着一类sRNAs可以调控特定的基因,可在组织间移动,并具有从亲代传递给子代的能力。这些sRNA在维持环境诱导的基因沉默从一代传递给下一代方面具有一定潜力。sRNA的跨代遗传效应可能成为"开关"或是内部自我约束的定时器,使生物体能够调整反应并使其适应环境。本研究着重综述了植物的sRNA特性,sRNA的流动性,RNA介导的跨代遗传及植物遗传胁迫反应。

关键词：跨代遗传 sRNA 基因沉默

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CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑文库筛选在植物中的应用

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分子植物育种 2021年第18期19卷 6051-6058页

作者：王洁吴怀通南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037 南京林业大学林学院南方现代林业协同创新中心南京210037

CRISPR/Cas9系统通过对基因的定向编辑,对基因组编辑产生了革命性的影响,成功促进了突变体筛选在基因组水平上的新发展。虽然该系统构建突变体文库速度快,针对性强,且具有巨大的应用前景,目前在一些重要作物的研究中已取得了重要进展,... 详细信息

CRISPR/Cas9系统通过对基因的定向编辑,对基因组编辑产生了革命性的影响,成功促进了突变体筛选在基因组水平上的新发展。虽然该系统构建突变体文库速度快,针对性强,且具有巨大的应用前景,目前在一些重要作物的研究中已取得了重要进展,但其在木本植物中的应用仍处于初级阶段。本研究总结了CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑文库构建方面的应用,探究该系统如何应用于构建突变敲除体库。将构建基因编辑突变体文库作为深入研究基因功能的手段,本研究综述的信息将对推进木本植物相关研究提供有益的借鉴。

关键词：基因组编辑 CRISPR/Cas9 突变体文库基因功能

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基于RAD-seq技术的鹅掌楸基因组SNP标记开发

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南京林业大学学报（自然科学版） 2019年第4期43卷 1-7页

作者：陆叶龙晓飞王鹏凯陈金慧施季森南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室江苏南京210037 南京林业大学南方现代林业协同创新中心江苏南京210037 苏州农业职业技术学院江苏苏州215008

【目的】开发大量可靠的SNP标记,为鹅掌楸高密度遗传连锁图谱的构建和基于基因组的林木选择育种提供分子基础。【方法】从北美鹅掌楸NK基因型为母本、鹅掌楸LS基因型为父本的F1代杂交群体中,选取198株个体为作图群体。用限制性内切酶Eco... 详细信息

【目的】开发大量可靠的SNP标记,为鹅掌楸高密度遗传连锁图谱的构建和基于基因组的林木选择育种提供分子基础。【方法】从北美鹅掌楸NK基因型为母本、鹅掌楸LS基因型为父本的F1代杂交群体中,选取198株个体为作图群体。用限制性内切酶EcoR I对包括2个亲本和198个子代在内的200个单株的基因组DNA进行酶切,构建RAD(restriction-site associated DNA)文库并进行RAD-seq测序。采用读长为91 bp的双末端测序。2个亲本的平均测序深度为2×,198个子代的平均测序深度为0.8×,平均产量为1.94 Gb,共获得约387.21 Gb数据。用Stacks软件将每个样品的RAD-reads作生物信息学分析,对候选位点进行卡方检验和缺失率检验,再将符合孟德尔遗传的标记及与之相对应的RAD-tag序列和鹅掌楸参考基因组序列进行比对。最后,从本研究开发的SNP标记中选取27个候选SNP位点,设计引物,对随机挑选的16个F1代进行PCR扩增并将结果进行测序,同时验证SNP的有效性。【结果】从候选群体中共鉴定到22 019个SNP位点,符合孟德尔遗传规律的标记为4 233个,最终获得3 501个候选SNP标记。SNP验证中,共有293个SNP标记完成测序并能判读结果,所有位点都为SNP位点,共有194(66.2%)个SNP变异类型得到了验证。【结论】基于RAD-seq技术和鹅掌楸参考基因组序列为基础的策略,能够作为一种快速有效的手段,实现大规模的分子标记开发,可用于鹅掌楸等林木的高密度遗传图谱的构建。

关键词：北美鹅掌楸鹅掌楸限制性位点关联DNA测序(RAD-seq)技术 SNP标记遗传连锁图谱

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杉木优树收集区无性系花期物候与同步性分析

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南京林业大学学报（自然科学版） 2020年第6期44卷 207-212页

作者：边黎明黄豆张学峰童鑫磊叶代全施季森南京林业大学林木遗传与生物技术教育部重点实验室南京林业大学林学院南方现代林业协同创新中心江苏南京21003 福建省洋口国有林场福建顺昌353211

【目的】了解杉木优树群体的开花物候和花期同步性,选择同步性指数高的无性系,指导交配设计和种子园的亲本选择。【方法】基于固定样株观测法,划分杉木优树94个嫁接无性系的雌雄球花类型与物候;利用花期同步指数,分析不同花期类型的同... 详细信息

【目的】了解杉木优树群体的开花物候和花期同步性,选择同步性指数高的无性系,指导交配设计和种子园的亲本选择。【方法】基于固定样株观测法,划分杉木优树94个嫁接无性系的雌雄球花类型与物候;利用花期同步指数,分析不同花期类型的同步性。【结果】雌球花平均比雄球花提前3 d进入花期,雌球花和雄球花初期持续时间约为1~8和1~9 d,平均约4 d后进入盛期,盛期为2~20和2~13 d,平均10和6 d后进入末期。全雌型、偏雌型、中性型、偏雄型和全雄型生殖特征无性系比例分别为3.2%、4.3%、5.3%、72.3%和14.9%。无性系作为父本和母本的平均同步指数为0.097~0.561和0.128~0.630。7280种不同交配组合中,同步指数的最小和最大值分别为0和0.976,其中,58%的无性系花期同步指数大于0.5,"早花型×早花型"、"中花型×早花型"和"中花型×中花型"则均大于0.64。【结论】花期物候在无性系之间存在差异,气候条件影响雌雄球花的分化,早花型和中花型具有较高的花期同步指数。

关键词：杉木优树收集区花期物候同步指数生殖特征

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MIXTA/MIXTA-like基因特征及其对植物表皮细胞分化的调控

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南京林业大学学报（自然科学版） 2021年第4期45卷 229-237页

作者：周芳伟吴怀通尹佟明教育部林木遗传与生物技术重点实验室江苏省林木遗传与高效培育重点实验室南京林业大学林学院南方现代林业协同创新中心江苏南京210037

植物表皮细胞是植物最外层直接与环境相互作用的细胞,依据其不同功能,分化形成多种具有防卫功能的特化细胞结构,在植物防御、减少蒸腾、授粉媒介吸引、种子散布、次生代谢产物合成与贮存等方面起着重要作用。研究发现MIXTA/MIXTA-like... 详细信息

植物表皮细胞是植物最外层直接与环境相互作用的细胞,依据其不同功能,分化形成多种具有防卫功能的特化细胞结构,在植物防御、减少蒸腾、授粉媒介吸引、种子散布、次生代谢产物合成与贮存等方面起着重要作用。研究发现MIXTA/MIXTA-like是多种植物表皮细胞分化的关键调控因子。在不同植物中,MIXTA/MIXTA-like作用部位(主要集中在花瓣、叶片、胚珠和子房)和调节方式不同,但最终都是通过调控表皮细胞分化发挥作用。MIXTA/MIXTA-like在表皮毛的形成、角质层生物合成、锥形表皮细胞的分化过程中起着重要的调节作用,其中植物表皮毛发育是一个研究热点。植物表皮毛有多种不同的功能:如叶片被毛是植物抵御取食昆虫的重要表型特征;法国梧桐、杨树、柳树飞絮都是种子成熟过程中表皮毛发育的结果;而黄花蒿中,青蒿素主要在腺毛中合成和储存。因此,开展植物表皮毛发育和调控机制研究具有重要意义。笔者梳理了MIXTA/MIXTA-like基因的特征及其在不同植物表皮细胞分化过程中的生物学功能,阐述了木本植物表皮毛发育调控的分子机制,为加速林木表皮毛发育相关性状的新品种培育提供借鉴。

关键词：植物表皮细胞角质层锥形表皮细胞表皮毛 MIXTA/MIXTA-like基因

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杨树Ptann3基因克隆与表达特性分析

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分子植物育种 2020年第15期18卷 4943-4951页

作者：王晓立魏辉武小龙张嘉鑫诸葛强南京林业大学生物与环境学院南方现代林业协同创新中心林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037

膜联蛋白(Annexin)是一类Ca2+及磷脂结合蛋白,在非生物逆境胁迫方面发挥重要作用,但木本模式植物杨树膜联蛋白基因的研究还未见报道。本研究通过RT-PCR与RACE相结合的方法从毛果杨(Populus trichocarpa)克隆获得膜联蛋白3 (Ptann3)基因c... 详细信息

膜联蛋白(Annexin)是一类Ca2+及磷脂结合蛋白,在非生物逆境胁迫方面发挥重要作用,但木本模式植物杨树膜联蛋白基因的研究还未见报道。本研究通过RT-PCR与RACE相结合的方法从毛果杨(Populus trichocarpa)克隆获得膜联蛋白3 (Ptann3)基因c DNA序列,分析发现编码蛋白质Ptann3与其他植物膜联蛋白高度同源,具有过氧化物酶活性结构域、S3氧化还原反应结构域、GTP结合结构域及钙结合位点。构建原核表达载体p ET-28a-Ptann3,转入大肠杆菌BL21 (DE3)中表达分析,Ptann3蛋白分子量35.6 kD,分析表明Ptann3蛋白具有过氧化物酶与ATPase活性。qPCR分析结果显示,Ptann3基因在根、上部茎、下部茎、叶柄、幼叶和成叶中均有表达,在幼叶中表达量最高,在叶柄和根中表达量次之,成叶和茎中表达量最低。此外,研究发现低温、ABA、PEG6000、H2O2和NaCl胁迫处理可显著影响Ptann3基因的表达,推测杨树Ptann3基因在非生物逆境胁迫中发挥重要作用,研究结果对杨树抗逆遗传改良具有重要意义。

关键词：杨树(Populus) 膜联蛋白3 表达特性非生物胁迫基因克隆

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杨树PePIF3基因的克隆与表达分析

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分子植物育种 2020年第3期18卷 840-846页

作者：许琦武小龙诸葛强南京林业大学生物与环境学院南方现代林业协同创新中心林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037

生物节律基因直接影响植物的生长发育,光敏色素相互作用因子3(phytochrome-interacting factor3,PIF3)属碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族,是生物节律中的一个关键因子,在分子水平上对植物所受到的环境变化起协同调控作用。本研究以‘南林... 详细信息

生物节律基因直接影响植物的生长发育,光敏色素相互作用因子3(phytochrome-interacting factor3,PIF3)属碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族,是生物节律中的一个关键因子,在分子水平上对植物所受到的环境变化起协同调控作用。本研究以‘南林895’杨(Populus deltoides×***’Nanlin 895’)为材料,通过克隆获得杨树Pe PIF3基因,分别为Pe PIF3-1和Pe PIF3-2序列,长度为1686 bp和2142 bp,编码561个氨基酸和713个氨基酸,且均为亲水性蛋白。对Pe PIF3进行多序列比对分析,发现其与毛果杨和胡杨同源性最高。组织特异性分析显示PePIF3在杨树幼叶中表达量最高,在柄、茎和根组织中表达都较低。对自然条件下的杨树成熟叶中PePIF3的生物节律性变化规律分析发现其在黑暗中不断累积,上午表达量达最高,以后呈下降趋势。在全黑暗条件下,14 h前PePIF3-1和Pe PIF3-2二者的表达量变化趋势相似,但14 h后二者的表达量呈相反变化趋势。

关键词：杨树 PePIF3 光敏色素相互作用因子实时荧光定量PCR 昼夜节律

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38年生马尾松种源生长及材性联合分析

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南京林业大学学报（自然科学版） 2022年第3期46卷 203-212页

作者：胡兴峰吴帆孙晓波陈厚平殷安政季孔庶南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南方现代林业协同创新中心江苏南京210037 安徽省六安市裕安区国有林木良种场安徽六安237010

【目的】通过分析已达成熟期的马尾松种源生长与材性变异,揭示不同性状在地理种源上的变异规律,并筛选适合在安徽省六安市及类似立地区域推广的速生且材质优良的纸浆材种源。【方法】以安徽省六安市裕安区国有林木良种场的38年生(成熟林... 详细信息

【目的】通过分析已达成熟期的马尾松种源生长与材性变异,揭示不同性状在地理种源上的变异规律,并筛选适合在安徽省六安市及类似立地区域推广的速生且材质优良的纸浆材种源。【方法】以安徽省六安市裕安区国有林木良种场的38年生(成熟林)马尾松55个种源为试材,测定其胸径、树高、管胞长度及宽度、基本密度和微纤丝角,进行生长与材性联合分析。【结果】胸径、树高、材积、管胞长度、管胞宽度、微纤丝角和基本密度在种源水平上均差异极显著(P<0.01)。各性状表型变异系数、遗传变异系数分别为3.02%~58.61%、5.56%~28. 16%;胸径、树高、材积、管胞长度、管胞宽度、基本密度和微纤丝角种源遗传力分别为0.665 7、0.558 9、0.616 9、0.996 3、0.965 6、0.739 3和0.823 3。相关性研究表明:生长性状与纬度呈显著负相关,与经度相关不显著;材性与经纬度均相关不显著,但表现出局部的变异规律;生长性状间相关性高于生长与材性间相关性;微纤丝角从髓心至树皮总体随着龄级的增大而减小,木材基本密度、管胞长和宽从髓心至树皮总体随着龄级的逐渐增大而增大,变化幅度随着龄级的增大而减小。通过综合指数选择出5个综合性状优良种源,其胸径、树高、材积、管胞长度与宽度、基本密度和微纤丝角平均遗传增益分别为3.69%、5.72%、15.12%、7.05%、-1.12%、0.17%和-6.46%。【结论】成熟林马尾松种源间差异显著,并且生长性状存在从南向北逐渐减小的变异规律,材性与经纬度不相关,对其进行纸浆材生长与材性联合选择具一定潜力,可为纸浆材马尾松良种选择提供可靠依据。

关键词：马尾松种源基本密度管胞微纤丝角材性

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