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分子植物育种 2021年

作者：侯静翟惠陈震霄刘晓胡正东尹佟明南京林业大学林学院南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南方现代林业协同创新中心

空气凤梨(Air plant)属凤梨科(Bromeliaceae)铁兰属(Tillandsia)多年生草本植物，是地球上唯一完全生于空气中的植物，具有绿化、美化、净化的作用，已成为室内装饰的新宠，市场需求量逐年增加。而空气凤梨主要依靠种子繁殖和分株繁殖...

空气凤梨(Air plant)属凤梨科(Bromeliaceae)铁兰属(Tillandsia)多年生草本植物，是地球上唯一完全生于空气中的植物，具有绿化、美化、净化的作用，已成为室内装饰的新宠，市场需求量逐年增加。而空气凤梨主要依靠种子繁殖和分株繁殖，繁殖速度极为缓慢，限制了空气凤梨的推广应用。加快空气凤梨繁殖速率是解决这一问题的关键。本研究以市场上的名贵品种‘肥猴’(Tillandsia duratii)为材料，以其成熟饱满的种子作为外植体，研究种子消毒、诱导种子萌发、促进植株生长、组培苗移栽的最适体系。结果显示，将‘肥猴’种子用70%的酒精消毒10 s，无菌水冲洗3次，然后用2%的次氯酸钠消毒5 min，无菌水冲洗5次，接种10 d后污染率为0%。含0.4 mg/L IAA的MS培养基为最适种子培养基，种子的发芽率达100%，一个月后幼苗可长出5片真叶，移入最适壮苗培养基(MS + IBA 2 mg/L)，90 d后幼苗平均叶片数为12片，平均株高为2.30 cm。以带孔的栎木作为基质，‘肥猴’组培苗的移栽成活率达100%，其生长速度较普通播种繁殖提高了10倍以上。本研究确定了‘肥猴’组织培养的最适消毒方法及最佳培养基，建立了‘肥猴’快速育苗体系，大大提高了空气凤梨‘肥猴’的繁殖速度。

关键词：

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中国鹅掌楸纤维素合酶的CRISPR/Cas9基因敲除系统的gRNA表达载体构建

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分子植物育种 2017年第6期15卷 2195-2199页

作者：徐惠芳金磊磊徐璇许梦璐张芳超郑晨陈金慧南京林业大学林学院林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037 南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京210037

CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用。... 详细信息

CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用。本研究以中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)为研究对象,首次构建了具有表达中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)gRNA(guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,以LcCESA1基因外显子5'端的第一个外显子区域的GN19NGG序列设计gRNA引物;以p201N-Cas9为载体,Gibson Assembly誖Master Mix为连接酶,通过Gibson Assembly连接技术,将CESA1-gRNA连入p201N-Cas9中,获得p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体。根据载体中插入序列,设计了两对检测引物,经PCR鉴定,均获得了相应大小的序列;测序分析进一步证实确认gRNA已经完整准确地连入载体。p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体能对CESA1基因进行定向编辑,对后续研究鹅掌楸纤维素合酶的基因功能具有重要意义。

关键词： CRISPR/Cas9系统中国鹅掌楸 gRNA 载体构建

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适合杨树叶片蛋白质组学样品制备方法的比较（英文）

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南京林业大学学报（自然科学版） 2018年第2期42卷 33-39页

作者：甄艳郑秀化施季森南方现代林业协同创新中心林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京林业大学林学院江苏南京210037

【目的】为了提高植物叶片中低丰度蛋白质的检测效率,建立有效的杨树叶片蛋白质组学分析的蛋白质提取方法。【方法】利用三氯乙酸-丙酮结合PEG分级提取方法和SDS-酚结合PEG分级提取方法对杨树叶片蛋白质进行提取,并采用SDS-PAGE和双向... 详细信息

【目的】为了提高植物叶片中低丰度蛋白质的检测效率,建立有效的杨树叶片蛋白质组学分析的蛋白质提取方法。【方法】利用三氯乙酸-丙酮结合PEG分级提取方法和SDS-酚结合PEG分级提取方法对杨树叶片蛋白质进行提取,并采用SDS-PAGE和双向凝胶电泳(2-DE)对提取结果进行评价。【结果】SDS-PAGE实验结果显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG方法优于SDS-酚结合PEG分级方法。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级和非结合PEG分级提取蛋白质的双向电泳结果表明,PEG分级能有效地去除高丰度蛋白质Rubisco,提高低丰度蛋白质的检测。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级法检测的蛋白质比非结合PEG分级法多90个蛋白质点。【结论】以LTQ-Orbitrap XL分析三氯乙酸-丙酮结合PEG分级分离的一些蛋白质显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG分级对于2-DE和MS鉴定低丰度蛋白质是一种有效的分离方法。

关键词：核酮糖-1,5-二磷酸羧化-加氧酶聚乙二醇分级杨树叶片双向电泳

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CRISPR/Cas技术及其作用机理

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分子植物育种 2022年第7期20卷 2310-2319页

作者：毛金燕翟惠王洁侯静南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037 南京林业大学林学院南方现代林业协同创新中心南京210037

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated)系统是一种原核生物的免疫系统,能够抵御外来病毒、质粒等遗传元件的入侵,为自身提供了获得性免疫保护机制。该系统具有操作简单、高效等优点... 详细信息

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated)系统是一种原核生物的免疫系统,能够抵御外来病毒、质粒等遗传元件的入侵,为自身提供了获得性免疫保护机制。该系统具有操作简单、高效等优点,通过改造使其成为了锌指核酸酶(ZFNs)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术之后的第三代定点编辑技术。目前,Cas9、Cas12、Cas13、Cas14等Cas蛋白相继出现,这些CRISPR/Cas系统在RNA的指导下,可对靶向的双链DNA、单链RNA和单链DNA进行编辑,在基因敲除或替换、转录调控、表观遗传调控、荧光成像及分子检测等领域具有广阔的应用前景。本研究将对CRISPR/Cas系统的来源、结构及其作用机理进行介绍,以期为CRISPR/Cas系统的应用研究提供一些有益参考。

关键词： CRISPR/Cas 定点编辑双链DNA 单链RNA 单链DNA

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根癌农杆菌介导的柳树痂囊腔菌遗传转化探究

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分子植物育种 2022年第18期20卷 6049-6056页

作者：程强赵丽娟南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南方现代林业协同创新中心南京210037

柳树痂囊腔菌是柳属植物重要的真菌病原,为了建立该真菌的遗传转化体系,本研究测试了柳树痂囊腔菌对潮霉素B、卡那霉素和草铵膦的敏感性,确定80μg/mL潮霉素B用于转化子筛选;构建了双元载体,使用构巢曲霉色氨酸合成基因启动子和柳树痂... 详细信息

柳树痂囊腔菌是柳属植物重要的真菌病原,为了建立该真菌的遗传转化体系,本研究测试了柳树痂囊腔菌对潮霉素B、卡那霉素和草铵膦的敏感性,确定80μg/mL潮霉素B用于转化子筛选;构建了双元载体,使用构巢曲霉色氨酸合成基因启动子和柳树痂囊腔菌翻译延伸因子基因启动子分别驱动潮霉素抗性基因和GFP基因;在农杆菌介导的遗传转化中发现使用生长6 d菌落的分生孢子作为受体材料,农杆菌诱导培养基为pH=5.2,并添加乙酰丁香酮200μg/mL的条件下,柳树痂囊腔菌转化效率为0.62个转化子/10000个孢子;抗性菌落的PCR检测产生特异性条带,定量PCR结果显示外源基因高水平表达,并且在蓝色激发光下释放绿色荧光。使用反向PCR鉴定T-DNA插入位点,在2个转化子中发现插入突变的目标基因,进一步分析未在这两个突变体中发现生长发育和致病性的改变。本研究在柳树痂囊腔菌中建立了高效的根癌农杆菌介导遗传转化方法,有利于该菌的基因功能研究,并且促进痂囊腔属真菌共有致病机制的探索。

关键词：柳树痂囊腔菌遗传转化农杆菌介导绿色荧光蛋白潮霉素B

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植物RNA-介导的表观跨代遗传

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分子植物育种 2019年第9期17卷 2850-2854页

作者：甄艳殷梓苡施季森南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京210037 南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037

环境胁迫反应的跨代遗传研究与日俱增。其中跨代表观遗传是DNA遗传状态的改变可传给下一代,但DNA序列没有改变。植物遗传信息的表观跨代传递可以依赖RNA的RNA聚合酶扩增sRNA (small RNA)的信息进行传递。植物体内存在着一类sRNAs可以调... 详细信息

环境胁迫反应的跨代遗传研究与日俱增。其中跨代表观遗传是DNA遗传状态的改变可传给下一代,但DNA序列没有改变。植物遗传信息的表观跨代传递可以依赖RNA的RNA聚合酶扩增sRNA (small RNA)的信息进行传递。植物体内存在着一类sRNAs可以调控特定的基因,可在组织间移动,并具有从亲代传递给子代的能力。这些sRNA在维持环境诱导的基因沉默从一代传递给下一代方面具有一定潜力。sRNA的跨代遗传效应可能成为"开关"或是内部自我约束的定时器,使生物体能够调整反应并使其适应环境。本研究着重综述了植物的sRNA特性,sRNA的流动性,RNA介导的跨代遗传及植物遗传胁迫反应。

关键词：跨代遗传 sRNA 基因沉默

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植物组织特异性生物钟研究进展

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分子植物育种 2018年第22期16卷 7527-7534页

作者：武小龙许琦刘铃诸葛强南京林业大学生物与环境学院南方现代林业协同创新中心林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037

组织特异性生物钟是指多细胞生物个体中生命活动在各组织中差异表达的由时序结构决定的内在节律性。在哺乳动物中,昼夜节律网络中的组织特异性分级一直广受争论,但是由于技术所限,在植物中研究甚少。对一些生物钟基因的研究,可以增强植... 详细信息

组织特异性生物钟是指多细胞生物个体中生命活动在各组织中差异表达的由时序结构决定的内在节律性。在哺乳动物中,昼夜节律网络中的组织特异性分级一直广受争论,但是由于技术所限,在植物中研究甚少。对一些生物钟基因的研究,可以增强植物的适应性和抗逆性,提高生物量。通过对组织特异性生物钟系统的修饰,我们可能会操纵目标组织来调节特异的农业性状。本研究对近期一些关于植物中组织特异性生物钟以及它们之间分级耦合网络的研究进行了分析总结,并描述了这些生物钟的组织特异性功能及其性质,进一步讨论了这一网络结构以及其中可能共享该网络时序信息的潜在信使。

关键词：生物钟昼夜节律组织特异性分级网络耦合因子

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基于RAD-seq技术的鹅掌楸基因组SNP标记开发

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南京林业大学学报（自然科学版） 2019年第4期43卷 1-7页

作者：陆叶龙晓飞王鹏凯陈金慧施季森南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室江苏南京210037 南京林业大学南方现代林业协同创新中心江苏南京210037 苏州农业职业技术学院江苏苏州215008

【目的】开发大量可靠的SNP标记,为鹅掌楸高密度遗传连锁图谱的构建和基于基因组的林木选择育种提供分子基础。【方法】从北美鹅掌楸NK基因型为母本、鹅掌楸LS基因型为父本的F1代杂交群体中,选取198株个体为作图群体。用限制性内切酶Eco... 详细信息

【目的】开发大量可靠的SNP标记,为鹅掌楸高密度遗传连锁图谱的构建和基于基因组的林木选择育种提供分子基础。【方法】从北美鹅掌楸NK基因型为母本、鹅掌楸LS基因型为父本的F1代杂交群体中,选取198株个体为作图群体。用限制性内切酶EcoR I对包括2个亲本和198个子代在内的200个单株的基因组DNA进行酶切,构建RAD(restriction-site associated DNA)文库并进行RAD-seq测序。采用读长为91 bp的双末端测序。2个亲本的平均测序深度为2×,198个子代的平均测序深度为0.8×,平均产量为1.94 Gb,共获得约387.21 Gb数据。用Stacks软件将每个样品的RAD-reads作生物信息学分析,对候选位点进行卡方检验和缺失率检验,再将符合孟德尔遗传的标记及与之相对应的RAD-tag序列和鹅掌楸参考基因组序列进行比对。最后,从本研究开发的SNP标记中选取27个候选SNP位点,设计引物,对随机挑选的16个F1代进行PCR扩增并将结果进行测序,同时验证SNP的有效性。【结果】从候选群体中共鉴定到22 019个SNP位点,符合孟德尔遗传规律的标记为4 233个,最终获得3 501个候选SNP标记。SNP验证中,共有293个SNP标记完成测序并能判读结果,所有位点都为SNP位点,共有194(66.2%)个SNP变异类型得到了验证。【结论】基于RAD-seq技术和鹅掌楸参考基因组序列为基础的策略,能够作为一种快速有效的手段,实现大规模的分子标记开发,可用于鹅掌楸等林木的高密度遗传图谱的构建。

关键词：北美鹅掌楸鹅掌楸限制性位点关联DNA测序(RAD-seq)技术 SNP标记遗传连锁图谱

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CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑文库筛选在植物中的应用

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分子植物育种 2021年第18期19卷 6051-6058页

作者：王洁吴怀通南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037 南京林业大学林学院南方现代林业协同创新中心南京210037

CRISPR/Cas9系统通过对基因的定向编辑,对基因组编辑产生了革命性的影响,成功促进了突变体筛选在基因组水平上的新发展。虽然该系统构建突变体文库速度快,针对性强,且具有巨大的应用前景,目前在一些重要作物的研究中已取得了重要进展,... 详细信息

CRISPR/Cas9系统通过对基因的定向编辑,对基因组编辑产生了革命性的影响,成功促进了突变体筛选在基因组水平上的新发展。虽然该系统构建突变体文库速度快,针对性强,且具有巨大的应用前景,目前在一些重要作物的研究中已取得了重要进展,但其在木本植物中的应用仍处于初级阶段。本研究总结了CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑文库构建方面的应用,探究该系统如何应用于构建突变敲除体库。将构建基因编辑突变体文库作为深入研究基因功能的手段,本研究综述的信息将对推进木本植物相关研究提供有益的借鉴。

关键词：基因组编辑 CRISPR/Cas9 突变体文库基因功能

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杉木优树收集区无性系花期物候与同步性分析

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南京林业大学学报（自然科学版） 2020年第6期44卷 207-212页

作者：边黎明黄豆张学峰童鑫磊叶代全施季森南京林业大学林木遗传与生物技术教育部重点实验室南京林业大学林学院南方现代林业协同创新中心江苏南京21003 福建省洋口国有林场福建顺昌353211

【目的】了解杉木优树群体的开花物候和花期同步性,选择同步性指数高的无性系,指导交配设计和种子园的亲本选择。【方法】基于固定样株观测法,划分杉木优树94个嫁接无性系的雌雄球花类型与物候;利用花期同步指数,分析不同花期类型的同... 详细信息

【目的】了解杉木优树群体的开花物候和花期同步性,选择同步性指数高的无性系,指导交配设计和种子园的亲本选择。【方法】基于固定样株观测法,划分杉木优树94个嫁接无性系的雌雄球花类型与物候;利用花期同步指数,分析不同花期类型的同步性。【结果】雌球花平均比雄球花提前3 d进入花期,雌球花和雄球花初期持续时间约为1~8和1~9 d,平均约4 d后进入盛期,盛期为2~20和2~13 d,平均10和6 d后进入末期。全雌型、偏雌型、中性型、偏雄型和全雄型生殖特征无性系比例分别为3.2%、4.3%、5.3%、72.3%和14.9%。无性系作为父本和母本的平均同步指数为0.097~0.561和0.128~0.630。7280种不同交配组合中,同步指数的最小和最大值分别为0和0.976,其中,58%的无性系花期同步指数大于0.5,"早花型×早花型"、"中花型×早花型"和"中花型×中花型"则均大于0.64。【结论】花期物候在无性系之间存在差异,气候条件影响雌雄球花的分化,早花型和中花型具有较高的花期同步指数。

关键词：杉木优树收集区花期物候同步指数生殖特征

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