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第十二届中国实验动物科学年会

作者：刘超董伟李冰谢英苏利波张力韩梅河北省实验动物重点实验室河北医科大学实验动物学部北京协和医学院比较医学中心中国医学科学院医学实验动物研究所河北省实验动物重点实验室河北医科大学实验动物学部北京协和医学院比较医学中心中国医学科学院医学实验动物研究所河北医科大学生物化学与分子生物学教研室河北省医学生物技术重点实验室

目的平滑肌22α(SM22α)是平滑肌细胞(VSMC)骨架相关蛋白,参与VSMC骨架重构,与动脉粥样硬化、高血压等血管重塑性疾病与关.本研究旨在在SM22α基因内部引入LoxP序列,制备基于Cre/LoxP系统的SM22α条件性基因敲除小鼠,研究其在VSMC骨架... 详细信息

目的平滑肌22α(SM22α)是平滑肌细胞(VSMC)骨架相关蛋白,参与VSMC骨架重构,与动脉粥样硬化、高血压等血管重塑性疾病与关.本研究旨在在SM22α基因内部引入LoxP序列,制备基于Cre/LoxP系统的SM22α条件性基因敲除小鼠,研究其在VSMC骨架重构中的作用机制.方法利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠SM22α基因.在外显子1～2和3～4的非编码区各设计sgRNA位点并将其定向克隆至pUC57-sgRNA.设计包含外显子2、3及2个LoxP序列且两侧各带有700bp同源臂的环状供体载体.Cas9的mRNA使用mMESSAGE mMACHINE(R) T7Ultra Kit进行体外转录,sgRNA使用线性化的spUC57-sgRNA重组质粒作为模板用MEGAshortscriptTM Kit体外转录合成.将制备好Cas9 mRNA、sgRNA和供体质粒进行混合,其浓度分别为Cas9 mRNA 25 ng/μl,sgRNA 10 ng/μl,供体质粒4 ng/μl.水平显微注射法将其导入170枚C57BL/6×B6D2F1受精卵原核.将注射后存活的约140枚受精卵移植入5只当日见栓的假孕KM雌鼠输卵管中,得到17只子代小鼠,经PCR和测序筛选目标小鼠.结果有一只小鼠等位基因的特定位点插入了LoxP序列,三只小鼠删除了SM22α基因的第2第3外显子.结论借助CRISPR/Cas9技术得到了SM22α基因内部引入LoxP序列的小鼠和SM22α基因敲除小鼠,为研究SM22α在VSMC中的作用机制提供了重要实验条件.

关键词： SM22α VSMC骨架重构 CRISPR/CAS9

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利用CRISPR/CAS9技术介导LoxP序列靶向引入小鼠SM22α基因

利用CRISPR/CAS9技术介导LoxP序列靶向引入小鼠SM22α基因

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第十二届中国实验动物科学年会（2016.南宁）

作者：刘超董伟李冰谢英苏利波张力韩梅河北省实验动物重点实验室河北医科大学实验动物学部北京协和医学院比较医学中心中国医学科学院医学实验动物研究所河北医科大学生物化学与分子生物学教研室河北省医学生物技术重点实验室

目的平滑肌22α（SM22α）是平滑肌细胞（VSMC）骨架相关蛋白,参与VSMC骨架重构,与动脉粥样硬化、高血压等血管重塑性疾病与关。本研究旨在在SM22α基因内部引入LoxP序列,制备基于Cre/L0xP系统的SM22α条件性基因敲除小鼠,研究其在VSMC... 详细信息

目的平滑肌22α（SM22α）是平滑肌细胞（VSMC）骨架相关蛋白,参与VSMC骨架重构,与动脉粥样硬化、高血压等血管重塑性疾病与关。本研究旨在在SM22α基因内部引入LoxP序列,制备基于Cre/L0xP系统的SM22α条件性基因敲除小鼠,研究其在VSMC骨架重构中的作用机制。方法利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠SM22α基因。在外显子1～2和3～4的非编码区各设计sgRNA位点并将其定向克隆至pUC57-sgRNA。设计包含外显子2、3及2个LoxP序列且两侧各带有700bp同源臂的环状供体载体。Cas9的mRNA使用mMESSAGE mMACHINE（?）T7Ultra Kit进行体外转录,sgRNA使用线性化的spUC57-sgRNA重组质粒作为模板用MEGAshortscriptKit体外转录合成。将制备好Cas9 mRNA、sgRNA和供体质粒进行混合,其浓度分别为Cas9 mRNA 25 ng/μl,sgRNA 10 ng/μl,供体质粒4 ng/μl。水平显微注射法将其导入170枚C57BL/6×B6D2F1受精卵原核。将注射后存活的约140枚受精卵移植入5只当日见栓的假孕KM雌鼠输卵管中,得到17只子代小鼠,经PCR和测序筛选目标小鼠。结果有一只小鼠等位基因的特定位点插入了LoxP序列,三只小鼠删除了SM22α基因的第2第3外显子。结论借助CRISPR/Cas9技术得到了SM22α基因内部引入LoxP序列的小鼠和SM22α基因敲除小鼠,为研究SM22α在VSMC中的作用机制提供了重要实验条件。

关键词： SM22a VSMC骨架重构 CRISPR/CAS9

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一种新的突变SOD1转基因小鼠模型的构建及鉴定

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第三军医大学学报 2014年第9期36卷 928-931页

作者：吴虹辰胡俊周晓杨王勇杨源瑞谢首佳史树贵第三军医大学西南医院神经内科重庆400038 第三军医大学基础医学部实验动物学教研室重庆400038

目的构建表达一种新的突变SOD1(mSOD1)转基因小鼠模型,观察其临床表型,明确该mSOD1类型与肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)的发病关系。方法构建携带mSOD1基因的PCI质粒载体,通过受精卵原核注射的方法制备转基因小鼠... 详细信息

目的构建表达一种新的突变SOD1(mSOD1)转基因小鼠模型,观察其临床表型,明确该mSOD1类型与肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)的发病关系。方法构建携带mSOD1基因的PCI质粒载体,通过受精卵原核注射的方法制备转基因小鼠。利用PCR方法鉴定出生的后代,采用转轮实验和足迹分析观察转基因小鼠的临床表型。结果 PCR结果证实获得了表达人mSOD1的转基因小鼠;行为学检测显示,转基因小鼠在转轮上停留时间为(59.17±26.27)s,明显短于野生型小鼠[(171.83±20.98)s,P<0.01],转基因小鼠在出生8个月左右出现双下肢跛行、拖曳,足迹欠规整,后肢足间距为(34.83±9.72)mm,明显小于野生型小鼠[(52.78±7.22)mm,P<0.01]。结论成功构建了mSOD1转基因小鼠,该转基因小鼠出现了类似ALS的临床表型。

关键词：肌萎缩侧索硬化症突变SOD1 转基因小鼠

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不同限饲水平下巴马香猪血液生理、生化指标的比较

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第三军医大学学报 2013年第11期35卷 1111-1114页

作者：李亮刘宇商海涛魏泓第三军医大学基础医学部实验动物学教研室重庆400038

目的测定不同限饲水平下巴马香猪重要血液生理、生化指标,探讨限饲对血液生理生化指标的影响。方法将336头断奶巴马香猪根据不同限饲水平按完全随机法分为对照组、80%日粮组和50%日粮组,每组112头,在60日龄和90日龄前腔静脉采集血液样本... 详细信息

目的测定不同限饲水平下巴马香猪重要血液生理、生化指标,探讨限饲对血液生理生化指标的影响。方法将336头断奶巴马香猪根据不同限饲水平按完全随机法分为对照组、80%日粮组和50%日粮组,每组112头,在60日龄和90日龄前腔静脉采集血液样本,对重要的10项血液生理指标和7项血液生化指标进行测定,统计不同限饲水平下指标的差异。结果血液生化指标中ALT、TP、UREA和CREA指标值随着限饲水平的上升而上升;而TCHOL和GLU指标值随着限饲水平的上升而下降(P<0.05)。血液生理指标中RBC、HGB、HCT、MCH和MCHC指标含量随着限饲水平的上升而上升;而PLT、MCV、RDW-SD和RDW-CV指标含量随着限饲水平的上升而下降(P<0.05)。结论巴马香猪在3个限饲水平下,血液生理、生化指标存在明显差异;按80%日粮限饲的巴马香猪更能获得稳定标准的巴马香猪血液生理、生化指标。

关键词：巴马香猪限饲血液生理血液生化

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抑制T细胞增殖的抗CD98重链单克隆抗体的建立

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中国实验动物学报 2013年第2期21卷 64-67页

作者：练高建吴端生苏泽红安友康二南华大学实验动物学部湖南衡阳421001 南华大学药学与生命科学学院湖南衡阳421001 日本德岛大学大学院免疫学教研室

目的寻找能调节T细胞功能的相关分子,进行与T细胞介导的自身免疫性疾病相关的研究。方法收集BALB/c小鼠脾细胞,免疫Wistar大鼠,进行细胞融合,建立杂交瘤细胞系。筛选得到43株能调节T细胞功能的杂交瘤细胞系,对其中一株最能抑制T细胞增... 详细信息

目的寻找能调节T细胞功能的相关分子,进行与T细胞介导的自身免疫性疾病相关的研究。方法收集BALB/c小鼠脾细胞,免疫Wistar大鼠,进行细胞融合,建立杂交瘤细胞系。筛选得到43株能调节T细胞功能的杂交瘤细胞系,对其中一株最能抑制T细胞增殖的杂交瘤细胞系进行了进一步的深入研究。结果显示其目标分子是CD98重链,同时后续实验显示抗CD98单克隆抗体能抑制纤连蛋白介导的细胞分布,但不影响氨基酸转运。而且混合淋巴细胞反应显示该抗体能显著抑制T细胞增殖反应。结论抗CD98单克隆抗体能有效抑制T细胞增殖,有望将本抗体用于T细胞介导的自身免疫性疾病的相关预防及治疗中。

关键词： CD98重链单克隆抗体抑制 T细胞增殖

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壳聚糖纳米包裹的IL-2与TpGpd核酸疫苗联合免疫后对Tp感染兔皮肤前后的免疫效应评估

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中国科学：生命科学 2013年第2期43卷 151-158页

作者：赵飞骏张晓红刘双全曾铁兵余坚张跃军顾伟鸣陈曦吴移谋南华大学病原生物学研究所衡阳421001 南华大学组织学与胚胎学教研室衡阳421001 南华大学附属第一医院检验科衡阳411000 南华大学实验动物学部衡阳421001 上海市皮肤病性病医院检验科上海200050 湖南省疾病预防控制中心长沙410005

梅毒是一种由梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）引起的临床表现复杂的性传播疾病,近年来世界各国包括中国的梅毒发病率呈逐年上升趋势,研制有效疫苗预防该种疾病已成为各国关注的公共卫生问题.DNA疫苗具有免疫效果好且持久、无毒力... 详细信息

梅毒是一种由梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）引起的临床表现复杂的性传播疾病,近年来世界各国包括中国的梅毒发病率呈逐年上升趋势,研制有效疫苗预防该种疾病已成为各国关注的公共卫生问题.DNA疫苗具有免疫效果好且持久、无毒力回复等特点成为近年来研究热点.对于Tp核酸疫苗研究,国内外除了本课题组构建TpDNA疫苗免疫新西兰兔进行免疫活性的初步研究外,尚未见Tp核酸疫苗的相关研究.本研究旨在探讨评价白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）与Tp膜蛋白GpdDNA疫苗用壳聚糖（chitosan,CS）纳米颗粒包裹联合免疫新西兰兔后对Tp皮肤感染后的保护效应.将真核表达重组体pcDNA3.1（＋）/IL-2和pcDNA3.1（＋）/TpGpd采用壳聚糖纳米颗粒包裹或未包裹方式处理后分别或联合免疫新西兰兔,每隔2周加强1次共免疫3次,并于初次免疫后第10周各实验组兔皮下接种Tp标准株进行背部皮肤感染实验,观察记录感染早期各实验组皮损的变化情况,在免疫及感染期间不同时间点ELISA检测免疫兔特异性抗体产生水平和脾细胞IL-2及IFN-诱导水平,MTT法检测兔脾细胞增殖水平.初步结果证实,pcD/IL-2基因佐剂可以显著加强pTpGpd疫苗在免疫期（0-8周）兔体内的特异性抗体及脾细胞增殖分化水平以及维持Tp感染后168天时间内长期稳定的高抗体水平及高脾细胞增殖分化水平.pcD/IL-2基因佐剂和CS纳米颗粒的联合使用对pcD/TpGpd疫苗的抗Tp皮肤感染的保护性效应达到最佳.

关键词：梅毒螺旋体膜蛋白 TpGpd IL-2 CS 核酸疫苗

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IL-2基因佐剂强化梅毒螺旋体外膜蛋白Tp92 DNA疫苗的免疫保护性研究

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中国病原生物学杂志 2013年第3期8卷 220-224页

作者：赵飞骏张晓红吴华曾铁兵刘双全曹训宇陈曦余坚南华大学医学院微生物学与免疫学教研室湖南衡阳421001 南华大学医学院组织学与胚胎学教研室衡阳市中心医院南华大学附属第一医院湖南省疾病预防控制中心南华大学实验动物学部

目的观察IL-2基因佐剂与梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)膜蛋白Tp92抗原编码基因DNA疫苗联合免疫新西兰兔后对Tp皮肤感染的免疫保护效果。方法将体重约3kg的新西兰兔随机分为pcDNA3.1(+)/IL-2+pcDNA3.1(+)/Tp92联合免疫组,pcDNA3.1(+... 详细信息

目的观察IL-2基因佐剂与梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)膜蛋白Tp92抗原编码基因DNA疫苗联合免疫新西兰兔后对Tp皮肤感染的免疫保护效果。方法将体重约3kg的新西兰兔随机分为pcDNA3.1(+)/IL-2+pcDNA3.1(+)/Tp92联合免疫组,pcDNA3.1(+)/Tp92免疫组,pcDNA3.1(+)空质粒组及PBS空白组共4组,每组18只,每隔2周免疫一次,共免疫3次,初次免疫后第10周进行Tp皮肤感染,观察并记录感染早期各组家兔皮损情况;ELISA检测感染后不同时间点免疫兔血清特异性抗体水平和脾细胞IL-2及IFN-γ水平;MTT法检测感染后不同时间点兔脾淋巴细胞增殖水平。结果 IL-2+Tp92DNA疫苗联合免疫组在Tp感染后0～224d期间的不同时间点均检测到高滴度的特异性IgG,与Tp92DNA疫苗组及各对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);感染后第14d联合免疫组兔脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-2水平均显著高于Tp92单独免疫组(P<0.05)及空质粒对照组和空白对照组(P<0.01),感染后不同时间点兔脾细胞均有明显增殖反应,SI值显著高于同期Tp92单独免疫组(P<0.05)及空质粒对照组和空白对照组(P<0.01)。Tp感染早期联合免疫组家兔皮损Tp阳性率为20%,溃疡病灶形成率为10%,皮损愈合时间为48d。结论 IL-2基因佐剂和Tp92DNA联合免疫能有效地诱导新西兰兔在Tp感染期间产生稳定持久保护性免疫应答,并能阻止Tp皮肤感染部位病损的发展。

关键词：梅毒螺旋体 IL-2 Tp92 联合免疫免疫保护

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慢病毒介导HLA-G转基因小鼠的建立

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第三军医大学学报 2012年第14期34卷 1392-1396页

作者：王露露刘勤周晓杨刘昌峨王勇魏泓第三军医大学基础医学部实验动物学教研室重庆400038

目的以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠,为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物。方法利用FUW载体,构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G。用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293F... 详细信息

目的以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠,为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物。方法利用FUW载体,构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G。用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293FT细胞,包装成慢病毒。通过同步转染含有绿色荧光标记基因的慢病毒质粒FUGW为参照,测定FUW-HLA-G病毒液的滴度。用显微注射法将浓缩后的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下,建立HLA-G转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因整合,用RT-PCR检测转基因在转录水平的表达,用Western blot检测HLA-G蛋白的表达。结果载体BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切结果和测序结果显示重组的慢病毒质粒与所设计的序列一致。浓缩和纯化后的病毒液滴度达到109TU/ml以上,符合用慢病毒制备转基因小鼠的要求。PCR筛选出阳性鼠6只,RT-PCR与Western blot检测结果表明HLA-G基因在F0和F1代转基因小鼠中均有表达。结论通过慢病毒介导的基因转移,成功建立了表达人HLA-G蛋白的转基因小鼠,为研究HLA-G的功能及其在器官或组织移植中的效应提供了动物模型。

关键词： HLA-G 慢病毒转基因小鼠

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SV40 PolyA序列及其AATAAA信号对上游GFP基因表达及转录终止的影响

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遗传 2012年第1期34卷 113-119页

作者：李书平冯晶晶王红钢王秀芳吕占军河北医科大学实验动物学部遗传研究室河北省实验动物重点实验室石家庄050017 河北省邢台市人民医院检验二科邢台054001 华东精神卫生康复中心上海200126 河南大学医学院生物化学与分子生物学教研室开封475004

SV40 PolyA(猴空泡病毒PolyA,简称PolyA)序列是有转录终止作用和使转录的mRNA添加PolyA尾的DNA序列(240 bp),含有AATAAA六核苷酸多腺苷化信号(Polyadenylation signal)。在pEGFP-C1质粒的GFP基因下游插入14个同向串联的Alu序列(Alu14),构建pAlu14质粒,瞬时转染HeLa细胞,用Northern blot检测和荧光显微镜观察GFP RNA和GFP蛋白表达,发现Alu串联序列强烈抑制GFP基因表达,该序列没有转录终止作用产生高分子量GFP融合RNA。又在pAlu14质粒GFP基因和Alu串联序列之间按正、反方向插入PolyA序列及去除AATAAA信号的PolyA序列,插入的这些PolyA序列均能部分解除Alu14对GFP基因的抑制作用;去除AATAAA信号的PolyA正、反序列仍然引起转录终止。将PolyA反序(PolyAas)分为4段每段60 bp,中间的2段分别称为2F2R和3F3R,将2F2R或3F3R插在pAlu14质粒的Alu串联序列的上游,随着插入2F2R片段拷贝数的增加转录的GFP融合RNA的分子量增加;2F2R的下游如果依然是2F2R那么2F2R可以支持转录延伸,如果2F2R下游是Alu串联序列则2F2R导致转录终止。无论插入一个3F3R或插入64个3F3R,均产生低分子量GFP RNA。

关键词： Alu SV40 PolyA AATAAA信号 GFP 转录终止

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人KB细胞和CCL227细胞与肿瘤球细胞超微结构的比较

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现代肿瘤医学 2012年第1期20卷 28-30页

作者：时伟红刘冬娟中国医科大学实验动物学部辽宁沈阳110001 中国医科大学组织学与胚胎学教研室辽宁沈阳110001

目的:比较人口腔癌KB细胞和结肠癌CCL227细胞与肿瘤球细胞的超微结构,为肿瘤干细胞研究提供更多的资料。方法:使用有血清培养液培养两种肿瘤细胞,无血清培养液分别诱导两种肿瘤细胞生成肿瘤球。常规方法制备KB细胞、CCL227细胞、KB肿瘤... 详细信息

目的:比较人口腔癌KB细胞和结肠癌CCL227细胞与肿瘤球细胞的超微结构,为肿瘤干细胞研究提供更多的资料。方法:使用有血清培养液培养两种肿瘤细胞,无血清培养液分别诱导两种肿瘤细胞生成肿瘤球。常规方法制备KB细胞、CCL227细胞、KB肿瘤球细胞、CCL227肿瘤球细胞透射电子显微镜切片,透射电子显微镜观察、拍照。结果:在四组样本中,细胞基本表现两种形态。一种细胞表面有突起,核糖体、线粒体数量相对较多。另一种细胞表面无突起,细胞核周围出现微丝,核糖体、线粒体数量减少,核内染色质出现靠边,后一种细胞在肿瘤球细胞中较多见。结论:伴随生理功能的改变,肿瘤干细胞的结构也发生了一些改变,这些改变可能会使蛋白合成下降。

关键词：口腔癌结肠癌超微结构肿瘤球细胞

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