[目的]通过比较常用的M-CSF与L929细胞培养上清两种诱导方式获得骨髓巨噬细胞(BMDM)的形态及基本生物学功能,为选择制备BMDM的方法提供实验依据。[方法]用两种方式诱导小鼠骨髓获取BMDM,然后分别利用Zeiss荧光显微镜和流式细胞仪比较BMDM的细胞形态及纯度;通过吞噬实验、杀菌实验以及液相芯片技术(liquid chip)比较两组BMDM的生物学功能;同时将上述结果与体内分化成熟的腹腔巨噬细胞相比较。[结果]两组诱导分化成熟的BMDM均呈现不规则形或梭形;BMDM的纯度分别为M-CSF组98.6%,L929上清组99.6%;腹腔细胞贴壁后巨噬细胞的纯度是98.8%;吞噬实验、杀菌实验两组之间及其与腹腔巨噬细胞相比无显著差异;炎症因子释放水平检测中3组细胞存在IL-6或TNF-α某些时间点释放水平差异。[结论]M-CS与L929上清诱导方式所获得BMDM的形态相似,纯度相近(98.6%比99.6%),吞噬细菌能力无显著统计学差异(21.31±5.83比26.10±6.11,t=-0.745,P>0.05),杀菌能力无显著差异(杀菌30min:36.41%±4.21%比39.53%±6.75%;60min:44.35%±6.75%比45.27%±1.96%,两者均P>0.05),但是炎症因子释放的某些时间点有差异(TNF-α的释放在LPS刺激后24 h M-CSF组高于L929组:549.92±412比271.47±432,t=-0.34,P<0.05),应根据实验目的选择获取BMDM的诱导方式。
目的通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4(SET domain-containing 4)蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。方法提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至p Fast Bac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆...
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目的通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4(SET domain-containing 4)蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。方法提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至p Fast Bac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆粒;通过脂质体介导将重组杆粒转染SF9细胞产生重组病毒,扩增病毒感染细胞并获得重组蛋白;利用Ni2+亲和柱来纯化蛋白,并通过Western Blot及考马斯亮蓝染色鉴定SETD4蛋白。结果经双酶切鉴定及测序证实SETD4基因插入了供体质粒;经PCR鉴定证实SETD4基因插入了穿梭载体;经考马斯亮蓝染色证实纯化得到重组蛋白,用His-Tag抗体和SETD4特异性抗体在50 k D处可检测到目的条带。结论成功利用昆虫杆状病毒表达系统够表达了SETD4,并纯化了SETD4。
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