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南方医科大学学报 2008年第4期28卷 509-512页

作者：柳玉红李建明周军丁彦青南方医科大学南方医院病理科南方医科大学基础医学院病理学教研室广东省分子肿瘤病理重点实验室教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室广东广州510515

目的构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系,为PRL-3基因功能研究奠定基础。方法设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体。通过与pENTRTM/U6 ent... 详细信息

目的构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系,为PRL-3基因功能研究奠定基础。方法设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体。通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体。利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系。结果成功构建PRL-3pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L。RT-PCR、Western blotting结果表明,克隆1PRL-3 mRNA及蛋白显著降低。结论成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系。

关键词： RNA干扰慢病毒 PRL-3 结直肠癌

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人大肠癌细胞PRL-3基因启动子Snail结合位点的初步研究

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南方医科大学学报 2007年第4期27卷 401-405页

作者：杨发达李建明周军柳玉红丁彦青南方医科大学南方医院病理科南方医科大学基础医学院病理学教研室广东省分子肿瘤病理重点实验室教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室广东广州510515

目的确定转录因子Snail可与PRL-3基因启动子区结合。方法应用生物信息学方法获得PRL-3基因启动子区域,并对其潜在的Snail结合位点进行预测,进一步应用Snail抗体染色质免疫共沉淀技术结合PCR技术检测PRL-3基因启动子序列,以确定转录因子S... 详细信息

目的确定转录因子Snail可与PRL-3基因启动子区结合。方法应用生物信息学方法获得PRL-3基因启动子区域,并对其潜在的Snail结合位点进行预测,进一步应用Snail抗体染色质免疫共沉淀技术结合PCR技术检测PRL-3基因启动子序列,以确定转录因子Snail可与PRL-3基因启动子结合。结果应用TRED在线分析系统确定PRL-3基因的启动子区域位于PRL-3基因上游-700bp至299bp之间,在该启动子区域存在多个转录因子如Snail、n-MYC、ARNT、E74A、NF-kappaB、NRF-2及AML-1等的结合位点;在启动子区域的-500bp至-451bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG,在其他多个区域存在多个类似这一核心序列的DNA序列;应用染色质免疫沉淀技术结合PCR扩增的方法对人大肠癌细胞株SW480细胞进行分析,发现Snail可与人大肠癌细胞株SW480PRL-3基因的启动子区域的DNA片断结合。结论转录因子Snail可与人大肠癌细胞SW480PRL-3基因启动子结合,参与PRL-3基因的调控。

关键词：染色质免疫沉淀技术 Snail 启动子,PRL-3

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PRL-3基因的克隆及其原核表达载体的构建表达

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南方医科大学学报 2007年第5期27卷 641-643页

作者：周军李建明柳玉红丁彦青南方医科大学南方医院病理科/南方医科大学基础医学院病理学教研室/教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室/广东省分子肿瘤病理重点实验室广东广州510515

目的克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体。方法设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3cDNA。经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3。结果成功扩... 详细信息

目的克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体。方法设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3cDNA。经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3。结果成功扩增出人PRL-3全长cDNA,并构建pGEX-4T-1-PRL-3原核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GenBank中PRL-3序列完全一致,SDS-PAGE胶分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组蛋白。结论获得人PRL-3基因全长cDNA并构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高效表达,为深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础。

关键词：大肠癌 PRL-3 基因克隆原核表达

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锌指转录因子Snail在结直肠癌中的表达及其意义

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南方医科大学学报 2008年第2期28卷 162-165页

作者：高维哲李建明杨发达周军丁彦青南方医科大学南方医院病理科/南方医科大学基础医学院病理学教研室/广东省分子肿瘤病理重点实验室/教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室广东广州510515

目的确定锌指转录因子Snail与结直肠癌发生发展及演进的相关性。方法应用免疫细胞化学及免疫荧光细胞化学方法分析Snail在结直肠癌细胞株SW480与SW620内的表达情况,同时以结直肠癌组织68例及对应癌旁组织68例、腺瘤组织33例、淋巴结转移... 详细信息

目的确定锌指转录因子Snail与结直肠癌发生发展及演进的相关性。方法应用免疫细胞化学及免疫荧光细胞化学方法分析Snail在结直肠癌细胞株SW480与SW620内的表达情况,同时以结直肠癌组织68例及对应癌旁组织68例、腺瘤组织33例、淋巴结转移癌35例为研究对象,运用免疫组织化学方法分析Snail在这些组织中的表达情况。结果Snail在结直肠癌细胞株SW620、SW480中的表达较强,Snail定位在结直肠癌细胞株SW620、SW480的细胞核里;Snail在正常结直肠粘膜、腺瘤、癌及淋巴结转移癌组织中的表达明显不同(χ2=92.852,P=0.000);两两比较发现,腺瘤Snail表达比正常结直肠黏膜组织强(P<0.01),淋巴结转移灶中癌组织Snail表达比原发结直肠癌组织强(P<0.01),而原发结直肠癌组织Snail表达比腺瘤组织强(P<0.01)。结论锌指转录因子Snail与结直肠癌发生、演进及转移相关。

关键词：锌指转录因子 Snail 结直肠肿瘤腺瘤淋巴结转移

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应用RNA干扰技术建立PRL-3和CDH22双基因表达抑制的结直肠癌细胞模型

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南方医科大学学报 2009年第4期29卷 593-597页

作者：姚娟丁彦青周军柳玉红李建明南方医科大学南方医院病理科南方医科大学基础医学院病理学系广东省分子肿瘤病理重点实验室教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室广东广州510515

目的建立稳定干扰PRL-3及CDH-22基因的结直肠癌细胞株,为探讨PRL-3、CDH22及其相互作用在结直肠发生及转移中的作用提供理想的细胞模型。方法以稳定干扰人PRL-3基因大肠癌SW480细胞的克隆为基础,以靶向人CDH22基因的RNAi慢病毒再次感染... 详细信息

目的建立稳定干扰PRL-3及CDH-22基因的结直肠癌细胞株,为探讨PRL-3、CDH22及其相互作用在结直肠发生及转移中的作用提供理想的细胞模型。方法以稳定干扰人PRL-3基因大肠癌SW480细胞的克隆为基础,以靶向人CDH22基因的RNAi慢病毒再次感染该细胞株,将经慢病毒二次感染的细胞悬液通过有限稀释法制备细胞单克隆,各细胞克隆扩大培养,荧光定量PCR检测各细胞克隆PRL-3及CDH22mRNA表达水平。结果应用于二次感染的慢病毒悬液的滴度为8×105U/ml。综合分析荧光定量PCR结果,所获得的细胞克隆中1号克隆PRL-3及CDH22mRNA水平的表达显著降低。结论成功建立PRL-3及CDH-22基因稳定敲低的大肠癌细胞克隆,探索同时敲低2个基因的慢病毒RNAi技术。

关键词： PRL-3 CDH22 RNA干扰慢病毒结直肠癌

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PRL-3真核绿色荧光蛋白表达载体的构建及其在结肠癌SW480细胞中的表达

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世界华人消化杂志 2008年第6期16卷 602-606页

作者：柳玉红李建明周军丁彦青南方医科大学南方医院病理科南方医科大学基础医学院病理学教研室广东省分子肿瘤病理重点实验室教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室广东省广州市510515

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PRL-3,为PRL-3基因功能研究奠定基础.方法:设计人PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW620细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核... 详细信息

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PRL-3,为PRL-3基因功能研究奠定基础.方法:设计人PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW620细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染大肠癌细胞SW480,应用G418进行筛选获取PRL-3稳定表达细胞克隆,应用荧光定量PCR检测PRL-3基因表达.结果:获得522 bp的PRL-3基因编码序列并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP.N1-PRL-3,该重组载体能够在SW480细胞中稳定表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-PRL-3和建立PRL-3稳定表达SW480细胞,为进一步深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定基础.

关键词：蛋白酪氨酸磷酸酶-3 真核表达绿色荧光蛋白稳定转染

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慢病毒载体法在制备转基因小鼠模型中的应用

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临床与实验病理学杂志 2009年第5期25卷 527-530页

作者：于莉娜张庆玲丁彦青南方医科大学南方医院病理科南方医科大学基础医学院病理学教研室广东省分子肿瘤病理重点实验室教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室广州510515

目的改进慢病毒载体法制备转基因小鼠的操作技术,分别从病毒浓缩、受精卵显微注射进针点和如何提高病毒注射效率等方面探讨慢病毒显微注射技术的最佳方案。方法超速离心获得浓缩慢病毒,通过卵周隙显微注射技术感染小鼠受精卵,比较不同... 详细信息

目的改进慢病毒载体法制备转基因小鼠的操作技术,分别从病毒浓缩、受精卵显微注射进针点和如何提高病毒注射效率等方面探讨慢病毒显微注射技术的最佳方案。方法超速离心获得浓缩慢病毒,通过卵周隙显微注射技术感染小鼠受精卵,比较不同注射点显微注射后受精卵存活率及发育情况。结果受精卵1点和5点作为注射点的卵周隙注射组可有效避免注射针与卵膜的直接碰触,减少对受精卵的损伤,胚胎存活率较常规中轴3点作为注射点组显著提高(P<0.01)。适当的病毒滴度和注入量、操作细节、注射针口径等均可影响注射后受精卵存活率和感染率。结论卵周隙显微注射过程中选择适当的注射点以及部分操作的改进,可显著提高受精卵的存活率,为提高转基因小鼠模型的制备效率提供参考。

关键词：慢病毒载体卵周隙注射转基因鼠

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Tiam1基因慢病毒表达载体构建及其在HT29细胞中的表达

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实用医学杂志 2010年第16期26卷 2895-2898页

作者：于莉娜张庆玲李新丁彦青南方医科大学南方医院病理科南方医科大学基础医学院病理学系广东省分子肿瘤病理重点实验室教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室广州市510515

目的:构建Tiam1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒表达载体,观察其在人结直肠癌HT29细胞中的表达。方法:通过酶切Tiam1/C1199HA质粒获得Tiam1cDNA片段,并将其克隆到慢病毒载体表达质粒pCDF1-copGFP中,经酶切、测序鉴定。慢病毒表达质... 详细信息

目的:构建Tiam1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒表达载体,观察其在人结直肠癌HT29细胞中的表达。方法:通过酶切Tiam1/C1199HA质粒获得Tiam1cDNA片段,并将其克隆到慢病毒载体表达质粒pCDF1-copGFP中,经酶切、测序鉴定。慢病毒表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带Tiam1和GFP融合基因的重组慢病毒。取病毒上清感染人结直肠HT29细胞株,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白及免疫细胞化学检测Tiam1在靶细胞中的表达。结果:重组慢病毒质粒pCDF1-Tiam1-copGFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的Tiam1基因序列(NM_003253)完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293FT细胞,病毒包装效率为88.34%。收获慢病毒上清可高效感染HT29细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光,感染效率为55.89%,感染后靶细胞中Tiam1稳定高表达。结论:成功构建了携带Tiam1与GFP融合基因的慢病毒表达载体pCDF1-Tiam1-copGFP,并使目的基因在靶细胞中得到稳定表达,为进一步研究Tiam1基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体。

关键词： Tiam1基因慢病毒载体基因转染

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慢病毒携带shRNA抑制CR-1基因表达对CNE-2细胞特性的影响

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中山大学学报（医学科学版） 2009年第6期30卷 671-676页

作者：吴正蓉吴立蓉姚开泰南方医科大学南方医院病理科∥基础医学院病理学系∥教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室∥广东省分子肿瘤病理重点实验室广东广州510515 广州中医药大学中药学院广东广州510006 南方医科大学基础医学院肿瘤研究所广东广州510515

【目的】应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术,有效沉默鼻咽癌细胞CNE-2的CR-1基因表达,研究CR-1对鼻咽癌细胞生物学行为的影响。【方法】构建针对CR-1的siRNA慢病毒表达载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]。利用包装细胞293FT生产慢病... 详细信息

【目的】应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术,有效沉默鼻咽癌细胞CNE-2的CR-1基因表达,研究CR-1对鼻咽癌细胞生物学行为的影响。【方法】构建针对CR-1的siRNA慢病毒表达载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]。利用包装细胞293FT生产慢病毒,感染鼻咽癌细胞CNE-2,流式筛选GFP阳性细胞。应用荧光定量PCR、Westernblot检测病毒感染后CNE-2细胞中CR-1基因的mRNA和蛋白表达,获得干扰CR-1基因的细胞群。并用MTT法、平板克隆形成实验及Boyden侵袭小室观察CR-1干扰后对CNE-2细胞生物学行为的影响。【结果】PCR和测序证实,成功构建了CR-1 shRNA的慢病毒载体pLVTHM-shCR-1。荧光定量PCR和Western blot结果表明,所获得的细胞中CR-1 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照组、空白对照组均显著降低(P<0.05)。CR-1干扰后的细胞生长明显减慢,克隆形成能力减弱,侵袭运动能力下降。【结论】通过RNAi技术阻断CR-1的表达,可抑制CNE-2细胞的生长、增殖、迁徙,提示CR-1在鼻咽癌的发生、发展过程中起重要作用。

关键词： RNA干扰慢病毒 CR-1 鼻咽癌

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人PRL-3基因真核表达载体构建及相关蛋白生物信息学分析

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中国热带医学 2008年第3期8卷 380-383页

作者：周军李建明杨发达柳玉红丁彦青南方医科大学南方医院病理科南方医科大学基础医学院病理学教研室教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室广东省分子肿瘤病理重点实验室广东广州510515

目的克隆人PRL-3基因并构建其真核表达载体,并运用生物信息学方法对PRL-3的相互作用蛋白进行预测分析。方法运用RT-PCR技术,从人大肠癌细胞系SW480细胞中扩增出人PRL-3cDNA,经T-A克隆,构建人PRL-3基因的真核表达载体pcDNA3-PRL-3,通过... 详细信息

目的克隆人PRL-3基因并构建其真核表达载体,并运用生物信息学方法对PRL-3的相互作用蛋白进行预测分析。方法运用RT-PCR技术,从人大肠癌细胞系SW480细胞中扩增出人PRL-3cDNA,经T-A克隆,构建人PRL-3基因的真核表达载体pcDNA3-PRL-3,通过双酶切鉴定及测序确认,并利用生物信息学方法预测分析其相互作用蛋白。结果成功扩增出人PRL-3全长cDNA,构建pcDNA3-PRL-3真核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GeneBank中PRL-3序列完全一致。利用模式生物果蝇相互作用蛋白数据库DIP,利用基于保守的蛋白相互作用分析方法,预测认为肌动蛋白家族成员ARP6和功能尚不清楚的小G蛋白家族ARL-3可能是PRL-3的相互作用蛋白,提示PRL-3可能是联系信号分子和细胞骨架系统的重要桥梁,参与构建了一条独特的结直肠癌转移信号途径。结论成功克隆PRL-3基因全长cDNA并构建其真核表达载体,并利用生物信息学方法,初步预测PRL-3的相互作用蛋白,为进一步深入研究PRL-3在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础。

关键词： PRL-3 蛋白相互作用生物信息学

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