[目的]通过比较常用的M-CSF与L929细胞培养上清两种诱导方式获得骨髓巨噬细胞(BMDM)的形态及基本生物学功能,为选择制备BMDM的方法提供实验依据。[方法]用两种方式诱导小鼠骨髓获取BMDM,然后分别利用Zeiss荧光显微镜和流式细胞仪比较BMDM的细胞形态及纯度;通过吞噬实验、杀菌实验以及液相芯片技术(liquid chip)比较两组BMDM的生物学功能;同时将上述结果与体内分化成熟的腹腔巨噬细胞相比较。[结果]两组诱导分化成熟的BMDM均呈现不规则形或梭形;BMDM的纯度分别为M-CSF组98.6%,L929上清组99.6%;腹腔细胞贴壁后巨噬细胞的纯度是98.8%;吞噬实验、杀菌实验两组之间及其与腹腔巨噬细胞相比无显著差异;炎症因子释放水平检测中3组细胞存在IL-6或TNF-α某些时间点释放水平差异。[结论]M-CS与L929上清诱导方式所获得BMDM的形态相似,纯度相近(98.6%比99.6%),吞噬细菌能力无显著统计学差异(21.31±5.83比26.10±6.11,t=-0.745,P>0.05),杀菌能力无显著差异(杀菌30min:36.41%±4.21%比39.53%±6.75%;60min:44.35%±6.75%比45.27%±1.96%,两者均P>0.05),但是炎症因子释放的某些时间点有差异(TNF-α的释放在LPS刺激后24 h M-CSF组高于L929组:549.92±412比271.47±432,t=-0.34,P<0.05),应根据实验目的选择获取BMDM的诱导方式。
目的通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4(SET domain-containing 4)蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。方法提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至p Fast Bac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆...
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目的通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4(SET domain-containing 4)蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。方法提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至p Fast Bac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆粒;通过脂质体介导将重组杆粒转染SF9细胞产生重组病毒,扩增病毒感染细胞并获得重组蛋白;利用Ni2+亲和柱来纯化蛋白,并通过Western Blot及考马斯亮蓝染色鉴定SETD4蛋白。结果经双酶切鉴定及测序证实SETD4基因插入了供体质粒;经PCR鉴定证实SETD4基因插入了穿梭载体;经考马斯亮蓝染色证实纯化得到重组蛋白,用His-Tag抗体和SETD4特异性抗体在50 k D处可检测到目的条带。结论成功利用昆虫杆状病毒表达系统够表达了SETD4,并纯化了SETD4。
目的:利用噬菌体随机肽库筛选与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽,为实现对肺泡Ⅱ型上皮细胞的靶向干预和开发针对急性肺损伤等呼吸系统疾病治疗的导向药物载体提供实验依据。方法:采用全细胞筛选的方式,通过对人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞的4轮筛选和与人前列腺癌上皮PC-3细胞的差减筛选,从噬菌体随机肽库中筛选出与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽,选择丰度较高的一条命名为NTG,用其构建含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)的原核表达载体,转化感受态细菌,层析法获得重组蛋白His-NTG-EGFP,测定其分子质量。向A549细胞和PC-3细胞分别加入含有重组蛋白His-NTG-EGFP或His-EGFP的培养基,荧光显微镜下观察。结果:从第1轮至第4轮,淘选所得的噬菌体回收率逐步提高,经过PC-3细胞差减筛选,少量的与A549细胞存在特异性结合的噬菌体得到了回收。重组表达并纯化得到的His-NTG-EGFP,测定其分子质量为33 k D,与预期相符。荧光显微镜下观察发现,经融合蛋白His-NTG-EGFP处理后的A549细胞表面有绿色荧光分布,经融合蛋白His-NTG-EGFP处理后的PC-3细胞以及经对照蛋白处理的A549细胞和PC-3细胞表面均未出现绿色荧光,说明这一融合蛋白可以特异性结合A549细胞。结论:人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性靶向肽被成功获得。
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