检索结果-内蒙古大学图书馆

贵阳医学院学报 2008年第4期33卷 340-343页

作者：邓鹏陈腾祥龚小卫南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的:构建绿色荧光蛋白-串联重复核定位信号融合蛋白的表达载体(His-EGFP-3xNLS),并在原核细胞中进行表达与纯化。方法:采用PCR方法从原先克隆在pEGFP-C1载体中的3xNLS与EGFP编码序列扩增出来,使用常规酶切和连接方法将其重组至pET-14b... 详细信息

目的:构建绿色荧光蛋白-串联重复核定位信号融合蛋白的表达载体(His-EGFP-3xNLS),并在原核细胞中进行表达与纯化。方法:采用PCR方法从原先克隆在pEGFP-C1载体中的3xNLS与EGFP编码序列扩增出来,使用常规酶切和连接方法将其重组至pET-14b载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株,用IPTG诱导融合蛋白表达,并利用Ni-NTA亲和层析纯化该融合蛋白。结果:构建的His-EGFP-3xNLS融合蛋白表达载体是正确的,该载体可在大肠杆菌内高效表达,用Ni-NTA纯化获得了相对分子质量约36 kD的融合蛋白。结论:成功构建了His-EGFP-3xNLS融合蛋白表达载体,并在原核细胞中获得了高效表达和纯化,为进一步研究NLS介导信号分子入核提供了实验材料。

关键词：核定位信号载体蛋白质类基因表达蛋白纯化

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人髓样相关蛋白14细胞内化的分子机制研究

人髓样相关蛋白14细胞内化的分子机制研究

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中国病理生理学会受体和信号转导专业委员会暨消化专业委员会联合学术会议

作者：刘铮徐佳伍丽琼王娟邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室

目的:初步探讨人髓样相关蛋白14（Myeloid-related protein-14:MRP14）在Hela细胞内化的分子机制。方法:将MRP14与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）融合表达,通过荧光定位观察方法检测MRP14是否具有内化... 详细信息

目的:初步探讨人髓样相关蛋白14（Myeloid-related protein-14:MRP14）在Hela细胞内化的分子机制。方法:将MRP14与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）融合表达,通过荧光定位观察方法检测MRP14是否具有内化活性;接着利用一系列与内化通路相关的抑制剂和荧光染料与带有绿色荧光的MRP14蛋白共同孵育细胞,通过荧光观察及荧光共定位方法阐明MRP14通过何种内化通路进行内化;之后在生物信息学基础上通过构建MRP14上不同结构域片断与EGFP的融合表达载体,利用荧光显微镜研究各功能域在介导MRP14内化过程中所起的作用;最后,利用溶酶体特异性染料和蛋白酶体抑制剂,证实了MRP14蛋白代谢与溶酶体代谢途径和泛素化代谢途径的相关性。结果:第一、MRP14以时间和能量依赖性方式通过内吞作用被哺乳动物细胞内化,内吞过程在15 min时已经开始,1h左右达到平衡,内吞的MRP14颗粒散在分布于细胞质内;第二、MRP14可能通过与细胞膜表面HSPG的HS链相互作用,并在其特异性受体协助下,通过依赖胞膜窖的内吞途径进入细胞,之后内吞小泡在细胞骨架协助下在细胞内运动,融合蛋白最终被蛋白酶体降解掉:第三、MRP14的内化是在Ca作用下.由两个钙离子结合基序协同作用,再由羧基末端的某个基序介导,进入细胞。结论:通过初步研究,我们提出一个新的MRP14作用于细胞的信号模型:在细胞外Ca存在的情况下,在细胞膜表面HSPG的HS的静电引力作用下,细胞外的MRP14首先被限制在靠近细胞膜的部位,接着在HS的协助下,与其特异性的受体相互作用,通过依赖胞膜窖的内吞途径进入细胞,入胞后的内吞小泡在细胞骨架协助下在细胞内运动,参与后续的信号反应,最终经泛素标记后,被蛋白酶体降解掉。

关键词：髓样相关蛋白内化依赖包涵素的内吞途径胞膜窖硫酸乙酰肝素蛋白多糖

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荧光差异双向电泳技术平台在疾病蛋白质组学中的应用

荧光差异双向电泳技术平台在疾病蛋白质组学中的应用

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中国病理生理学会受体和信号转导专业委员会暨消化专业委员会联合学术会议

作者：胡水旺姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室

目的:利用荧光差异双向电泳技术(Difference gel electrophoresis,DIGE)来寻找疾病过程中差异表达的蛋白质,为深入研究疾病的发病机制以及防治策略提供了稳定可靠的技术平台。方法:用三种不同的荧光染料(Cy2,Cy3,Cy5)分别标记不同的样品... 详细信息

目的:利用荧光差异双向电泳技术(Difference gel electrophoresis,DIGE)来寻找疾病过程中差异表达的蛋白质,为深入研究疾病的发病机制以及防治策略提供了稳定可靠的技术平台。方法:用三种不同的荧光染料(Cy2,Cy3,Cy5)分别标记不同的样品,其中Cy2标记内标,Cy3和Cy5分别标记正常对照组和疾病组蛋白样品,标记后淬灭荧光染料,混合一起进行双向电泳,接着利用Typhoon多功能荧光扫描仪扫描后每块胶便可以得到三个胶图,利用Decyder差异分析软件分析差异蛋白质,然后利用Spot picker全自动切胶仪进行挖点,对差异胶点进行胶内酶解后进行质谱分析,得到疾病中差异表达的蛋白质信息。结果:能快速找到疾病过程中的差异蛋白质组,并且具有很好的重复性和可信度。结论:成功建立了DIGE技术平台,为疾病蛋白质组学研究提供可靠的技术支持。

关键词：荧光差异双向电泳蛋白质组学疾病

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细胞信号转导的组学研究策略

细胞信号转导的组学研究策略

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中国病理生理学会受体和信号转导专业委员会暨消化专业委员会联合学术会议

作者：姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室，广州 510515

细胞信号系统(cell signaling system)控制着细胞的代谢、增生、分化、迁移、细胞凋亡、炎症反应和应激适应等功能活动。在真核细胞，各种细胞过程往往并非单个信号转导分子或单一信号通路就能完成的，而是受到多个信号元件组成的信号... 详细信息

细胞信号系统(cell signaling system)控制着细胞的代谢、增生、分化、迁移、细胞凋亡、炎症反应和应激适应等功能活动。在真核细胞，各种细胞过程往往并非单个信号转导分子或单一信号通路就能完成的，而是受到多个信号元件组成的信号网络的精密调控。细胞的生命过程并不仅是许多独立反应的简单总和，而是由多种信号调节形式的复杂组合。经典的针对单一信号分子的研究模式，可能无法适应后基因组时代(post genome era)的综合集成式揭示生命活动机制的要求，因此，发展以系统生物学为指导思想的各种“组学(Omics)”技术和研究策略已经成为生命科学研究的必然趋势。本文集中介绍如何应用基因组学、蛋白质组学、噬菌体展示、酵母双杂交、生物信息学、生物质谱分析等技术来大规模、高通量、集成式研究蛋白信号分子的相互作用、调节机制及其生物学功能。

关键词：蛋白质组学信号分子复合物信号转导网络质谱分析

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绿色荧光标记C-反应蛋白的原核表达和毛细管电泳检测

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贵阳医学院学报 2008年第5期33卷 441-445页

作者：陈腾祥夏高晓陈丽刘亚伟刘靖华姜勇贵阳医学院生理学教研室贵州贵阳550004 南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的:表达纯化重组的His-EGFP-CRP蛋白,通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价。方法:用pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析,获得复性的His-EGFP-CR... 详细信息

目的:表达纯化重组的His-EGFP-CRP蛋白,通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价。方法:用pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析,获得复性的His-EGFP-CRP蛋白;并用高效毛细管电泳(HPCE)技术对复性的蛋白进行检测,了解蛋白质的等电点及活性。结果:转化实验发现,该质粒pET14b/EGFP-hCRP在BL21(DE3)中能够被诱导表达;通过包涵体变性溶解、亲和色谱纯化可获得纯度较高的His-EGFP-CRP蛋白;HPCE分离发现复性后的His-EGFP-CRP蛋白峰为多个,其在电泳液pH值低于6时易检出,His-EGFP-CRP与THP-1细胞裂解物孵育后的检测峰增多。结论:成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白His-EGFP-CRP,通过包涵体变性溶解及亲和色谱纯化获得该重组蛋白,复性后的His-EGFP-CRP等电点接近于6,以单体或多聚体等结构形式存在,具有结合活性,能与细胞内相关分子结合成复合物,可应用于CRP功能和内化机制的研究。

关键词： C反应蛋白基因表达蛋白质复性电泳,毛细管

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医学生物化学内毒素诱导性基因启动子结合蛋白的筛选新方法及其应用

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中国学术期刊文摘 2008年第9期14卷 130页

作者：王娟刘志锋徐佳杨莉李志杰邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室广州510515广州510515

建立研究DNA-蛋白质相互作用的新方法.选择6只SPF级BALB/c小鼠,模型组经尾静脉注射脂多糖(LPS)25mg/kg,使平均动脉压(MAP)降至40mmHg(1mmHg=0.133kPa)造成内毒素休克,然后迅速处死,正常对照组同期处死,取肝脏组织.利用生物素.链亲和素... 详细信息

建立研究DNA-蛋白质相互作用的新方法.选择6只SPF级BALB/c小鼠,模型组经尾静脉注射脂多糖(LPS)25mg/kg,使平均动脉压(MAP)降至40mmHg(1mmHg=0.133kPa)造成内毒素休克,然后迅速处死,正常对照组同期处死,取肝脏组织.利用生物素.链亲和素系统结合磁珠分离技术筛选内毒素诱导基因(LIG)启动子的结合蛋白.

关键词： DNA-蛋白质相互作用启动子生物素-链亲和素基因表达调控

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丝裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶(MK)研究进展

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生物化学与生物物理进展 2007年第7期34卷 695-701页

作者：龚小卫姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室广州510515

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路介导多种重要的细胞生理反应.对下游蛋白激酶的磷酸化是MAPK家族成员发挥生理作用的重要方式.在MAPK的下游存在3个结构上相关的MAPK激活蛋白激酶(MAPKAPKorMK),即MK2,MK3和MK5.在被MAPK激活后,MK可将... 详细信息

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路介导多种重要的细胞生理反应.对下游蛋白激酶的磷酸化是MAPK家族成员发挥生理作用的重要方式.在MAPK的下游存在3个结构上相关的MAPK激活蛋白激酶(MAPKAPKorMK),即MK2,MK3和MK5.在被MAPK激活后,MK可将信号传递至细胞内不同靶标,从而在转录和翻译水平调节基因表达,调控细胞骨架和细胞周期,介导细胞迁移和胚胎发育.最近,在基因敲除研究的基础上,不同MK亚族成员之间的功能区分已经逐渐明晰,使我们对于MK的认识有了长足的进步.

关键词：丝裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶丝裂原活化蛋白激酶信号转导

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细胞穿透肽在肿瘤治疗中的应用

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生理科学进展 2007年第4期38卷 301-306页

作者：黄劭刘亚伟姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室广州510515

随着人类对基因组信息解读的不断深入,越来越多的生物大分子作为候选药物进入生物治疗领域。但细胞表面的脂质双层膜具有选择通透性,这种天然屏障作用在保护细胞的同时也限制了绝大多数生物大分子进入细胞内部发挥治疗效应。目前流行的... 详细信息

随着人类对基因组信息解读的不断深入,越来越多的生物大分子作为候选药物进入生物治疗领域。但细胞表面的脂质双层膜具有选择通透性,这种天然屏障作用在保护细胞的同时也限制了绝大多数生物大分子进入细胞内部发挥治疗效应。目前流行的入胞转运方式如电穿孔、脂质体转染等均存在对细胞的额外毒副作用,且作用范围局限于体外实验。细胞穿透肽是一类以非受体依赖方式,非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽。它们可以与多种生物活性物质连接并携带其进入细胞,这一特性为它们成为理想的药物载体提供了可能。本文对使用细胞穿透肽作为载体转运具有抗癌作用的生物大分子进入细胞的抗癌实验予以介绍。

关键词：肿瘤细胞穿透多肽跨膜转运

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p53基因敲除对细胞迁移的影响

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南方医科大学学报 2007年第8期27卷 1132-1135页

作者：龚小卫魏洁李煜生程蔚蔚王旭邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的研究p53基因敲除对细胞迁移的影响。方法观察p53+/+和p53-/-细胞中血清诱导的板状伪足形成情况,以及利用Transwell细胞迁移系统观察p53基因敲除对血清诱导的细胞迁移的影响。结果在血清诱导下,p53+/+细胞能形成板状伪足和进行迁移,... 详细信息

目的研究p53基因敲除对细胞迁移的影响。方法观察p53+/+和p53-/-细胞中血清诱导的板状伪足形成情况,以及利用Transwell细胞迁移系统观察p53基因敲除对血清诱导的细胞迁移的影响。结果在血清诱导下,p53+/+细胞能形成板状伪足和进行迁移,而p53-/-细胞中板状伪足的形成和细胞迁移都被阻断。结论p53在血清诱导的细胞迁移中具有重要作用。

关键词： p53 基因敲除细胞迁移

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晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达

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南方医科大学学报 2007年第7期27卷 983-986页

作者：李煜生龚小卫程蔚蔚魏洁姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体。方法采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。以RAGE/pcDNA3重组质粒... 详细信息

目的构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体。方法采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列。利用Western blotting在HEK293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测。结果RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK293细胞中表达。结论成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具。

关键词： RAGE 载体构建基因表达

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