检索结果-内蒙古大学图书馆

中国危重病急救医学 2008年第1期20卷 14-17页

作者：王娟刘志锋徐佳杨莉李志杰邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室广州510515

目的建立研究DNA-蛋白质相互作用的新方法。方法选择6只SPF级BALB／c小鼠，模型组经尾静脉注射脂多糖（LPS）25mg／kg，使平均动脉压（MAP）降至40mmHg（1mmHg=0．133kPa）造成内毒素休克，然后迅速处死，正常对照组同期处死，取肝脏组... 详细信息

目的建立研究DNA-蛋白质相互作用的新方法。方法选择6只SPF级BALB／c小鼠，模型组经尾静脉注射脂多糖（LPS）25mg／kg，使平均动脉压（MAP）降至40mmHg（1mmHg=0．133kPa）造成内毒素休克，然后迅速处死，正常对照组同期处死，取肝脏组织。利用生物素一链亲和素系统结合磁珠分离技术筛选内毒素诱导基因（LIG）启动子的结合蛋白。用聚合酶链反应（PCR）扩增末端带生物素标记的LIG启动子探针，提取动物肝脏组织胞核蛋白，与制备的LIG启动子探针进行孵育，再以标记有链亲和素的磁珠分离LIG启动子-蛋白反应复合物，使用不同浓度NaCl洗脱结合的蛋白，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分离样品蛋白，并对凝胶进行银染显色，比较模型组与正常对照组的差异条带。结果两组胞核蛋白中共观察到15条差异条带。分析差异条带显示，与正常对照组比较，在低亲和力作用水平，LPS作用后有4个蛋白开始与LIG启动子作用力增强，而有1个蛋白则同启动子的相互作用减弱；在DNA-蛋白质高亲和力作用水平，则有9个蛋白因LPS刺激而同DNA的结合力增强，有1个蛋白同启动子的相互作用消失。结论成功建立了生物素-链亲和素结合磁珠分离技术的新方法，为研究DNA-蛋白质相互作用开拓了新思路，并从“转录调控组学”角度深入理解基因表达调控机制奠定了基础。

关键词： DNA-蛋白质相互作用启动子生物素-链亲和素基因表达调控

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p53基因敲除对细胞迁移的影响

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南方医科大学学报 2007年第8期27卷 1132-1135页

作者：龚小卫魏洁李煜生程蔚蔚王旭邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的研究p53基因敲除对细胞迁移的影响。方法观察p53+/+和p53-/-细胞中血清诱导的板状伪足形成情况,以及利用Transwell细胞迁移系统观察p53基因敲除对血清诱导的细胞迁移的影响。结果在血清诱导下,p53+/+细胞能形成板状伪足和进行迁移,... 详细信息

目的研究p53基因敲除对细胞迁移的影响。方法观察p53+/+和p53-/-细胞中血清诱导的板状伪足形成情况,以及利用Transwell细胞迁移系统观察p53基因敲除对血清诱导的细胞迁移的影响。结果在血清诱导下,p53+/+细胞能形成板状伪足和进行迁移,而p53-/-细胞中板状伪足的形成和细胞迁移都被阻断。结论p53在血清诱导的细胞迁移中具有重要作用。

关键词： p53 基因敲除细胞迁移

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整合素介导的细胞信号转导研究进展

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生理科学进展 2005年第4期36卷 353-356页

作者：刘瑜姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省功能蛋白质组学重点实验室广州510515

整合素是细胞表面重要的受体,介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的粘附.整合素通过与ECM配体结合可活化特定的信号转导途径,引起细胞发生反应,包括形态改变、伸展、迁移、增殖、分化、存活等,从而决定了与细胞... 详细信息

整合素是细胞表面重要的受体,介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的粘附.整合素通过与ECM配体结合可活化特定的信号转导途径,引起细胞发生反应,包括形态改变、伸展、迁移、增殖、分化、存活等,从而决定了与细胞粘附相关的多种生物学功能.因此,对整合素介导的信号转导过程的认识将有助于人们对细胞粘附机制和功能的理解.

关键词：整合素信号转导胞内域结合蛋白双向跨膜信号转导

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一种基于HIV-1TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建

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南方医科大学学报 2006年第5期26卷 545-548页

作者：郭爱华刘志锋孙学刚李海玉邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、... 详细信息

目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化***21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确,再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中,用荧光显微镜观察。结果重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体,正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体,His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达,并具有明确的细胞内转导活性。

关键词： HIV-1反式激活因子蛋白质转导结构域融合蛋白细胞内转导

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晚期糖基化终末产物受体不同突变体真核表达载体的构建和表达

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南方医科大学学报 2008年第10期28卷 1779-1781,1785页

作者：程蔚蔚李煜生龚小卫赵琳琳王继刚邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体(RAGE)不同突变体的真核细胞表达载体。方法采用定点突变技术将亚克隆在载体pcDNA3-HA上的野生型RAGE构建成不同突变体pcDNA3-HA-RAGE(S391A)、pcDNA3-HA-RAGE(S399A)、pcDNA3-HA-RAGE(S400A)、pcDNA3-HA-RAGE(T401A),经测序鉴定正确后转染HEK293细胞,利用Westernblotting检测各突变体的表达。结果RAGE不同突变体经测序鉴定正确无误后,在HEK293细胞中得到高量表达。结论成功构建了RAGE不同突变体的真核表达载体,并在真核细胞中进行了表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导中的作用奠定了基础。

关键词：晚期糖基化终末产物受体定点突变载体构建基因表达

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整合素α_v重组腺病毒的构建和鉴定及对人肝癌细胞黏附特性的影响

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中国危重病急救医学 2006年第7期18卷 413-416,F0005页

作者：李旭艳刘靖华李志杰莫永炎刘亚伟刘志锋邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的构建表达人整合素αv亚基(整合素αv)重组腺病毒,并在人肝癌细胞株SMMC7721细胞中表达,探讨整合素αv对肝癌细胞黏附特性的影响。方法将人整合素αvcDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pAd-Track巨细胞病毒(CMV)启动子下游,与腺病毒骨架质粒pA... 详细信息

目的构建表达人整合素αv亚基(整合素αv)重组腺病毒,并在人肝癌细胞株SMMC7721细胞中表达,探讨整合素αv对肝癌细胞黏附特性的影响。方法将人整合素αvcDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pAd-Track巨细胞病毒(CMV)启动子下游,与腺病毒骨架质粒pAdEasy1在细菌内同源重组,在HEK293A细胞中包装成整合素αv重组腺病毒。以重组腺病毒感染SMMC7721细胞24h后,用蛋白质免疫印迹法(West-ernblot)检测整合素αv的表达;通过黏附实验研究其对SMMC7721细胞黏附的影响。结果构建了整合素αv重组腺病毒载体并制备出高滴度重组腺病毒。重组腺病毒感染SMMC7721细胞后,整合素αv能够正确表达,并且SMMC7721细胞黏附率显著高于对照组和空白组(P<0.01)。结论整合素αv基因在SMMC7721细胞的黏附中起重要作用,是肿瘤转移的重要分子基础。

关键词：整合素细胞黏附腺病毒载体

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晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达

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南方医科大学学报 2007年第7期27卷 983-986页

作者：李煜生龚小卫程蔚蔚魏洁姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体。方法采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。以RAGE/pcDNA3重组质粒... 详细信息

目的构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体。方法采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列。利用Western blotting在HEK293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测。结果RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK293细胞中表达。结论成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具。

关键词： RAGE 载体构建基因表达

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基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究

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南方医科大学学报 2006年第5期26卷 553-557页

作者：杨丽萍刘志锋黎永明李志杰姜勇南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高... 详细信息

目的构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高渗刺激下,通过检测p38底物ATF2的磷酸化水平,以观察由TAT转导进入细胞His-TAT-p38及其无活性突变体对内源性p38活性的影响。结果酶切和测序结果表明,载体构建正确;SDS-PAGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白;Westernblot表明,融合蛋白His-TAT-p38及其突变体能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞;导入His-TAT-p38蛋白后,结果发现导入的野生型p38可增强内源性p38的功能,而无活性突变体则竞争性抑制了内源性p38MAPK蛋白的功能,从而阻止或抑制其对内源性底物ATF2的磷酸化,使得信号不能传递下去,进而抑制p38MAPK通路的活动。结论成功建立了基于TAT的蛋白转运系统,并证实TAT能够以浓度和时间依赖方式高效转运蛋白进入真核细胞;进入细胞的His-TAT-p38和His-TAT-p38无活性突变体蛋白均具有较高的生物学活性,在高渗刺激作用下前者可以增加p38磷酸化水平,而后者则显著抑制p38信号通路的活性。

关键词： Ⅰ型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白 p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白转导

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人高迁移率族蛋白B1细胞内定位及移位研究

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中国危重病急救医学 2006年第6期18卷 338-341页

作者：徐佳刘志锋王娟邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室广州510515

目的观察人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在真核细胞内的定位和移位情况。方法构建人HMGB1及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的哺乳动物细胞表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合表达形式克隆到带有血凝素(hytohe... 详细信息

目的观察人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在真核细胞内的定位和移位情况。方法构建人HMGB1及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的哺乳动物细胞表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合表达形式克隆到带有血凝素(hytohemagglutinin,HA)标记的载体pcDNA3HA上,随后转染293A细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定证明构建正确,并在293A细胞中得到大量表达。荧光显微镜观察发现,融合蛋白主要分布于细胞核中,经肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激后18h,部分细胞中融合蛋白从胞核移位到胞质,与预期结果一致。结论HMGB1的绿色荧光蛋白融合表达载体构建成功。该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位、移位,为下一步深入研究HMGB1作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具。

关键词：高迁移率族蛋白B1 增强型绿色荧光蛋白细胞内定位载体构建

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NF-κB信号通路对BLP耐受巨噬细胞iNOS表达的影响

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中国临床解剖学杂志 2014年第3期32卷 300-305页

作者：李雪王义乾罗海华钟玙沄雷烨铭雷山蔡军伟姜勇刘靖华广东省蛋白质组学重点实验室南方医科大学病理生理学教研室广州510515

目的通过检测细菌脂蛋白(BLP)耐受巨噬细胞感染细菌时诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达情况及其表达是否受NF-κB信号通路调控,探讨BLP耐受巨噬细胞对细菌清除能力增强的机制。方法比较BLP耐受和非耐受(Naive)小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMM)... 详细信息

目的通过检测细菌脂蛋白(BLP)耐受巨噬细胞感染细菌时诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达情况及其表达是否受NF-κB信号通路调控,探讨BLP耐受巨噬细胞对细菌清除能力增强的机制。方法比较BLP耐受和非耐受(Naive)小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMM)对大肠杆菌的吞噬及杀灭情况,评价BLP耐受巨噬细胞的细菌清除能力;用定量PCR技术检测BLP耐受的BMM内iNOS mRNA表达情况和细胞免疫荧光技术观察p65从胞质向胞核的移位情况;最后观察抑制NF-κB通路活化对iNOS mRNA表达的影响。结果 BLP耐受巨噬细胞吞噬细菌和杀灭细菌的能力较Naive细胞显著增强(P<0.05);iNOS mRNA表达水平较Naive细胞显著(P<0.05);如果抑制BLP耐受巨噬细胞NF-κB通路活化对iNOS mRNA表达有显著影响(P<0.05)。结论本研究结果提示细菌脂蛋白耐受通过NF-κB通路活化增强细菌感染巨噬细胞iNOS表达。

关键词： BLP耐受细菌吞噬 iNOS NF—κB

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