检索结果-内蒙古大学图书馆

贵阳医学院学报 2007年第4期32卷 341-344页

作者：龚小卫彭毅唐靖魏洁邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的:构建p38调节/激活蛋白激酶(PRAK)不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中表达后,观察这些突变体在细胞内的定位情况。方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型PRAK通过定点突变技术构建其无活性突变体PRAK(... 详细信息

目的:构建p38调节/激活蛋白激酶(PRAK)不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中表达后,观察这些突变体在细胞内的定位情况。方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型PRAK通过定点突变技术构建其无活性突变体PRAK(T182A)、活性突变体PRAK(T182D)、无激酶活性突变体PRAK(KM)、核定位信号缺失突变体PRAK(NLSm)及核输出信号缺失突变体PRAK(NESm),随后转染NIH3T3细胞,并在荧光显微镜下观察其表达和细胞内定位情况。结果:经测序鉴定各种PRAK不同突变体正确无误后,在NIH3T3细胞中得到高量表达;融合蛋白发出的绿色荧光表明,在静息状态下,野生型PRAK(WT)、PRAK(182A)、PRAK(182D)、PRAK(KM)和PRAK(NESm)主要分布于细胞核内,而PRAK(NLSm)在细胞中均匀分布;在受到NaAsO2刺激后,PRAK(WT)和PRAK(KM)移位出核,而PRAK(182A)、PRAK(182D)和PRAK(NESm)失去了移位出核的能力,PRAK(NLSm)则与刺激前无明显差异。结论:成功构建了PRAK不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并在真核细胞中进行了表达,且不同的突变体能够影响PRAK的细胞内定位。

关键词： p38调节/激活蛋白激酶点突变载体构建基因表达细胞内定位

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一种基于HIV-1TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建

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南方医科大学学报 2006年第5期26卷 545-548页

作者：郭爱华刘志锋孙学刚李海玉邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、... 详细信息

目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化***21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确,再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中,用荧光显微镜观察。结果重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体,正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体,His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达,并具有明确的细胞内转导活性。

关键词： HIV-1反式激活因子蛋白质转导结构域融合蛋白细胞内转导

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整合素α_v重组腺病毒的构建和鉴定及对人肝癌细胞黏附特性的影响

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中国危重病急救医学 2006年第7期18卷 413-416,F0005页

作者：李旭艳刘靖华李志杰莫永炎刘亚伟刘志锋邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的构建表达人整合素αv亚基(整合素αv)重组腺病毒,并在人肝癌细胞株SMMC7721细胞中表达,探讨整合素αv对肝癌细胞黏附特性的影响。方法将人整合素αvcDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pAd-Track巨细胞病毒(CMV)启动子下游,与腺病毒骨架质粒pA... 详细信息

目的构建表达人整合素αv亚基(整合素αv)重组腺病毒,并在人肝癌细胞株SMMC7721细胞中表达,探讨整合素αv对肝癌细胞黏附特性的影响。方法将人整合素αvcDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pAd-Track巨细胞病毒(CMV)启动子下游,与腺病毒骨架质粒pAdEasy1在细菌内同源重组,在HEK293A细胞中包装成整合素αv重组腺病毒。以重组腺病毒感染SMMC7721细胞24h后,用蛋白质免疫印迹法(West-ernblot)检测整合素αv的表达;通过黏附实验研究其对SMMC7721细胞黏附的影响。结果构建了整合素αv重组腺病毒载体并制备出高滴度重组腺病毒。重组腺病毒感染SMMC7721细胞后,整合素αv能够正确表达,并且SMMC7721细胞黏附率显著高于对照组和空白组(P<0.01)。结论整合素αv基因在SMMC7721细胞的黏附中起重要作用,是肿瘤转移的重要分子基础。

关键词：整合素细胞黏附腺病毒载体

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基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究

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南方医科大学学报 2006年第5期26卷 553-557页

作者：杨丽萍刘志锋黎永明李志杰姜勇南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高... 详细信息

目的构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高渗刺激下,通过检测p38底物ATF2的磷酸化水平,以观察由TAT转导进入细胞His-TAT-p38及其无活性突变体对内源性p38活性的影响。结果酶切和测序结果表明,载体构建正确;SDS-PAGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白;Westernblot表明,融合蛋白His-TAT-p38及其突变体能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞;导入His-TAT-p38蛋白后,结果发现导入的野生型p38可增强内源性p38的功能,而无活性突变体则竞争性抑制了内源性p38MAPK蛋白的功能,从而阻止或抑制其对内源性底物ATF2的磷酸化,使得信号不能传递下去,进而抑制p38MAPK通路的活动。结论成功建立了基于TAT的蛋白转运系统,并证实TAT能够以浓度和时间依赖方式高效转运蛋白进入真核细胞;进入细胞的His-TAT-p38和His-TAT-p38无活性突变体蛋白均具有较高的生物学活性,在高渗刺激作用下前者可以增加p38磷酸化水平,而后者则显著抑制p38信号通路的活性。

关键词： Ⅰ型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白 p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白转导

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人高迁移率族蛋白B1细胞内定位及移位研究

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中国危重病急救医学 2006年第6期18卷 338-341页

作者：徐佳刘志锋王娟邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室广州510515

目的观察人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在真核细胞内的定位和移位情况。方法构建人HMGB1及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的哺乳动物细胞表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合表达形式克隆到带有血凝素(hytohe... 详细信息

目的观察人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在真核细胞内的定位和移位情况。方法构建人HMGB1及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的哺乳动物细胞表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合表达形式克隆到带有血凝素(hytohemagglutinin,HA)标记的载体pcDNA3HA上,随后转染293A细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定证明构建正确,并在293A细胞中得到大量表达。荧光显微镜观察发现,融合蛋白主要分布于细胞核中,经肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激后18h,部分细胞中融合蛋白从胞核移位到胞质,与预期结果一致。结论HMGB1的绿色荧光蛋白融合表达载体构建成功。该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位、移位,为下一步深入研究HMGB1作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具。

关键词：高迁移率族蛋白B1 增强型绿色荧光蛋白细胞内定位载体构建

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p38L12-TAT融合肽对山梨糖醇引起的ECV304细胞ATF2磷酸化的抑制作用

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第5期22卷 402-408页

作者：郭爱华刘志锋李海玉唐靖李志杰刘亚伟龚小卫刘靖华邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室广州510515

构建p38Loop12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“TXY”双磷酸化位点的AF突变体p38L12(AF)片段,克隆入His标记的TATEGFP融合蛋白原核表达载体pHTE(pET1... 详细信息

构建p38Loop12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“TXY”双磷酸化位点的AF突变体p38L12(AF)片段,克隆入His标记的TATEGFP融合蛋白原核表达载体pHTE(pET14bHisTATEGFP),经酶切、测序鉴定正确后,将重组质粒转化原核表达菌,诱导表达纯化融合蛋白;将融合蛋白加入ECV304细胞后于荧光显微镜下观察并行Western印迹分析,检测融合蛋白的细胞内转导活性;通过检测内源性ATF2磷酸化水平,鉴定高渗刺激下p38L12对内源性p38活性的影响.成功构建了p38L12和p38L12(AF)片段与TAT的融合表达载体,并获得相应的融合蛋白.在ECV304细胞中可见导入的HTEp38L12和HTEp38L12(AF)融合蛋白具有较高的细胞内转导活性和转导效率,并可竞争性抑制高渗刺激对内源性p38的活化.基于HIV1TAT细胞转导系统证实p38L12可竞争性抑制高渗刺激诱导的内源性p38对ATF2的活化,从而发挥对p38激活特异性抑制的功能.

关键词： Ⅰ型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白丝裂原活化蛋白 Loop 12 细胞转导系统

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一种用于穿透多肽筛选的随机文库的构建及筛选

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第6期22卷 491-497页

作者：刘瑜刘亚伟李海玉刘靖华邓鹏姜勇南方医科大学广东省功能蛋白质组学重点实验室和病理生理学教研室广州510515

以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)为示踪物,在pET-14b载体上构建编码12个氨基酸的随机多肽表达文库.建立一种简便、经济、有效的文库筛选方法,从所构建的文库中筛选出细胞穿透多肽(cell-penetratingpeptide... 详细信息

以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)为示踪物,在pET-14b载体上构建编码12个氨基酸的随机多肽表达文库.建立一种简便、经济、有效的文库筛选方法,从所构建的文库中筛选出细胞穿透多肽(cell-penetratingpeptide,CPP).采用点突变技术,首先在pET-14b载体多克隆位点NdeⅠ和XhoⅠ之间加入4个限制性内切酶位点,随后在BamHⅠ位点后加入三联终止密码子,接着再利用亚克隆的方法在KpnⅠ和XhoⅠ之间插入EGFP,形成一个新的用于原核表达示踪蛋白的载体pET-14bMCStop/EGFP.最后再利用点突变技术在上述构建的示踪载体的多克隆位点XhoⅠ和BamHⅠ之间插入36个随机碱基序列.以His-Tat-EGFP作为工具建立有效的筛选方法,利用这种方法对文库进行筛选.酶切和测序表明,示踪载体的构建是正确的,且在大肠杆菌中可有效地表达出His标记的EGFP.在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库至少包含了105个独立克隆,其中90%以上的克隆插入的随机片段都是36个碱基.建立的筛选方法是可行的,并用此方法进行了初步的筛选.

关键词：细胞穿透多肽随机多肽文库跨膜转运内化

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人DJ-1蛋白在NIH3T3细胞中的表达与定位

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第7期22卷 530-534页

作者：唐靖刘靖华蓝兴国李志杰刘亚伟赵明哲邓鹏姜勇南方医科大学广东省功能蛋白质组学重点实验室和病理生理学教研室广州510515

采用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）示踪的方法,研究人DJ-1蛋白在真核细胞中的定位及其对刺激的反应.将克隆在pGEX-KG上的DJ-1亚克隆到载体pEGFP-C2上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染NIH3T3细胞;并用荧光显微镜观察pEGFP-... 详细信息

采用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）示踪的方法,研究人DJ-1蛋白在真核细胞中的定位及其对刺激的反应.将克隆在pGEX-KG上的DJ-1亚克隆到载体pEGFP-C2上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染NIH3T3细胞;并用荧光显微镜观察pEGFP-DJ-1在细胞内的定位以及在血清刺激时的移位;探讨在氧化应激时DJ-1对细胞的保护作用,以及其在细胞内定位的变化.重组质粒在NIH3T3细胞中得到高效表达,绿色荧光弥散分布于胞质、胞核中,但以胞质居多;血清刺激后,细胞中的绿色荧光从胞质移位到胞核;在200～600 μmol/L H2O2刺激下,DJ-1能有效保护细胞抵抗氧化应激,并且也能从胞质移位到胞核.上述研究结果为进一步研究DJ-1蛋白的功能提供了一个重要依据.

关键词： DJ-1蛋白增强型绿色荧光蛋白双氧水血清转染

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人高迁移率族蛋白1的原核细胞表达及其功能研究

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中国病理生理杂志 2006年第6期22卷 1119-1123页

作者：赵雷刘靖华唐靖李志杰刘亚伟邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的:构建带His标记的人高迁移率族蛋白1(HMGB1)融合蛋白原核细胞表达质粒,表达并纯化人HMGB1重组蛋白,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响。方法:首先将目的片段HMGB1亚克隆到改造的载体pET14b上,经鉴定、测序证实序... 详细信息

目的:构建带His标记的人高迁移率族蛋白1(HMGB1)融合蛋白原核细胞表达质粒,表达并纯化人HMGB1重组蛋白,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响。方法:首先将目的片段HMGB1亚克隆到改造的载体pET14b上,经鉴定、测序证实序列正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-HMGB1融合蛋白,用Ni-NTA亲和树脂纯化。将纯化得到的HMGB1蛋白经透析和过滤除菌后,刺激人脐静脉内皮细胞,24h后收集培养上清,经LiquiChip液相蛋白芯片系统检测细胞因子。结果:构建的pET14b/HMGB1表达质粒经酶切和测序验证正确;表达的目的蛋白经Western blotting验证能被His抗体识别;检查了纯化的HMGB1蛋白对HUVEC产生细胞因子的影响,发现重组的HMGB1可诱导白细胞介素8(IL-8)上调,并且呈剂量依赖性关系。结论:成功构建了His-HMGB1原核细胞表达质粒并纯化得到重组的HMGB1;在HUVEC模型上证实所得到的HMGB1蛋白具有生物学活性。本实验为进一步研究HMGB1的功能提供了重要的实验材料。

关键词：高迁移率族蛋白质类原核表达细胞因子类脐静脉内皮细胞

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双色红外荧光技术在蛋白磷酸化检测中的应用

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南方医科大学学报 2006年第2期26卷 150-153页

作者：刘靖华唐靖蓝兴国刘亚伟李志杰陈芳邓鹏姜勇南方医科大学病理生理学教研室和广东省功能蛋白质组重点实验室广东广州510515 基因有限公司上海200233

目的通过与化学发光法比较,了解双色红外荧光技术在目标蛋白磷酸化检测中的优势。方法分别取内毒素休克小鼠不同时间肺组织,制备组织匀浆蛋白样品。用SDS-PAGE电泳分离后转膜,将膜分别与磷酸化的或／和总的 p42／44 MAPK抗体孵育,二抗... 详细信息

目的通过与化学发光法比较,了解双色红外荧光技术在目标蛋白磷酸化检测中的优势。方法分别取内毒素休克小鼠不同时间肺组织,制备组织匀浆蛋白样品。用SDS-PAGE电泳分离后转膜,将膜分别与磷酸化的或／和总的 p42／44 MAPK抗体孵育,二抗用耦联有Alexa Fluor 680和IRDye 800的荧光抗体或辣根过氧化物酶抗体,通过双色红外荧光系统和化学发光法进行蛋白质磷酸化检测。结果红外荧光检测技术和化学发光检测结果均显示内毒素处理后小鼠肺组织p42／44 MAPK磷酸化水平发生了改变,1 h最高,12 h以后逐渐恢复到接近正常水平。两种方法检测结果显示了较好的一致性,相比之下双色红外荧光技术具有更高的灵敏度、操作方便、节省时间及可以同时检测两种蛋白等优点。结论双色红外荧光技术在蛋白磷酸化的检测方面具有较好的应用前景。

关键词：蛋白质磷酸化双色红外荧光化学发光检测

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