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中国病理生理杂志 2017年第5期33卷 793-797页

作者：胡明珠李磊曹蕾张一梅罗海华胡水旺刘爱华姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室南方医院呼吸科广东广州510515

目的:探讨PXD101(又称belinostat)诱导人前列腺癌PC3细胞凋亡的线粒体通路。方法:PXD101以不同刺激时间和剂量处理PC3细胞,CCK-8法检测细胞的活力;流式细胞术检测细胞的凋亡率和线粒体膜电位;Western blot检测线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2... 详细信息

目的:探讨PXD101(又称belinostat)诱导人前列腺癌PC3细胞凋亡的线粒体通路。方法:PXD101以不同刺激时间和剂量处理PC3细胞,CCK-8法检测细胞的活力;流式细胞术检测细胞的凋亡率和线粒体膜电位;Western blot检测线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、细胞色素C(Cyt C)和Bax;caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性。结果:PXD101能以时间和剂量依赖的方式抑制PC3细胞的存活(P<0.05),流式细胞术检测结果表明PXD101处理后PC3细胞的凋亡率明显增加(P<0.01)。PXD101能时间依赖性致线粒体膜电位降低和Bcl-2蛋白含量明显下降,Bax蛋白含量上升,促进线粒体释放Cyt C蛋白,caspase-3活性明显增强。结论:PXD101通过线粒体途径诱导人前列腺癌细胞系PC3细胞凋亡。

关键词：前列腺癌 PXD101 细胞凋亡线粒体 PC3细胞

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p38 MAPK在MRP8/14诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡中的作用

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山东医药 2017年第28期57卷 28-32页

作者：王娟陈小欢李磊卢夏英姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室广州510515

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)对髓样相关蛋白8(MRP8)/髓样相关蛋白14(MRP14)诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡的影响。方法制备MRP8、MRP14、MRP8/14备用。分别取p38^(+/+)和p38-/-细胞,随机分为空白对照组、MRP8组、MRP14组、MR... 详细信息

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)对髓样相关蛋白8(MRP8)/髓样相关蛋白14(MRP14)诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡的影响。方法制备MRP8、MRP14、MRP8/14备用。分别取p38^(+/+)和p38-/-细胞,随机分为空白对照组、MRP8组、MRP14组、MRP8/14组。MRP8组、MRP14组、MRP8/14组分别加入50μg/m L MRP8、MRP14和MRP8/14。空白对照组加入等体积的DMEM培养液。各组干预24、48 h,采用MTT法检测p38^(+/+)和p38-/-细胞活力。采用流式细胞术检测空白对照组及MRP8/14干预24、48 h组p38^(+/+)和p38-/-细胞凋亡率。采用MTT法检测空白对照组、MRP8/14组以及TLR4受体抑制剂TAK242或RAGE中和抗体处理的MRP8/14(分别设为MRP8/14+TAK242组、MRP8/14+RAGE组)干预24 h p38^(+/+)细胞活力。采用MTT法和流式细胞术检测空白对照组、MRP8/14组以及p38激酶抑制剂SB203580处理的MRP8/14(设为MRP8/14+SB203580组)干预24 h p38^(+/+)细胞活力和凋亡率。采用Western blotting法检测MRP8/14干预0、1、2、4、6、8 h p38^(+/+)细胞p38 MAPK磷酸化。结果 MRP8组、MRP14组、MRP8/14组干预24、48 h p38^(+/+)、p38-/-细胞活力均低于空白对照组(P均<0.05),但无论MRP8/14组干预24 h还是48 h,p38-/-细胞活力明显高于p38^(+/+)细胞(P均<0.05)。MRP8/14干预24、48 h组p38^(+/+)细胞凋亡率均高于空白对照组,且MRP8/14干预48 h组细胞凋亡率更高(P均<0.05);而MRP8/14干预24、48 h组p38-/-细胞凋亡率均未见明显变化(P均>0.05)。MRP8/14组、MRP8/14+RAGE组干预24 h p38^(+/+)细胞活力低于空白对照组、MRP8/14+TAK242组干预24 h(P均<0.05)。MRP8/14+SB203580组干预24 h p38^(+/+)细胞活力较MRP8/14组干预24 h明显升高,细胞凋亡率较MRP8/14组干预24 h明显降低(P均<0.05)。MRP8/14干预2、4、6 h p38^(+/+)细胞p38 MAPK磷酸化水平明显高于干预0、1、8 h(P均<0.05)。结论 p38 MAPK能促进MRP8/14诱导的小鼠成纤维细胞凋亡,其机制可能与TLR4-p38 MAPK信号通路激活有关。

关键词：胚胎成纤维细胞髓样相关蛋白8 髓样相关蛋白14 p38丝裂原活化蛋白激酶细胞凋亡小鼠

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STC2促进人肝癌细胞HepG2增殖和EMT相关的迁移

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中国病理生理杂志 2017年第6期33卷 1000-1005页

作者：曹蕾李磊胡明珠张一梅罗海华胡水旺刘爱华姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515 南方医科大学南方医院呼吸科广东广州510515

目的:探讨斯钙素2(STC2)对人肝癌细胞HepG2增殖、迁移以及上皮-间充质转化(EMT)进程的影响。方法:Western blot法检测不同肝癌细胞株及正常肝细胞株的STC2蛋白表达情况;集落形成实验分析STC2对HepG2细胞增殖的影响,同时进一步采用实时... 详细信息

目的:探讨斯钙素2(STC2)对人肝癌细胞HepG2增殖、迁移以及上皮-间充质转化(EMT)进程的影响。方法:Western blot法检测不同肝癌细胞株及正常肝细胞株的STC2蛋白表达情况;集落形成实验分析STC2对HepG2细胞增殖的影响,同时进一步采用实时荧光定量PCR及Western blot法检测STC2对cyclin D1等增殖相关基因的表达变化;Transwell实验分析STC2对肝癌细胞HepG2迁移能力的影响,采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测过表达和沉默STC2的细胞中EMT分子标志物vimentin和E-cadherin的表达情况。结果:与正常肝细胞系相比,STC2蛋白在肝癌细胞中高表达。集落形成实验结果说明STC2促进HepG2细胞的增殖,同时STC2可以显著影响cyclin D1等增殖相关基因的表达。Transwell实验结果说明STC2增强HepG2细胞的迁移能力,同时显著影响肝癌细胞的EMT过程。结论:STC2能够促进肝癌细胞系HepG2的增殖并且影响增殖相关基因的表达,进一步研究表明STC2能够影响肝癌细胞的EMT过程,促进肝癌细胞的迁移。

关键词：肝细胞癌斯钙素2 上皮-间充质转化细胞迁移

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咯利普兰通过NF-κB抑制MRP8/14在RAW264.7细胞中促炎性因子的释放

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中国病理生理杂志 2017年第6期33卷 1098-1103页

作者：杨晨王俊黄林罗海华姜勇刘爱华南方医科大学南方医院呼吸内科广东广州510515 南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的:探讨PDE4抑制剂咯利普兰抑制髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7中促炎性因子释放的刺激作用,并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法:MRP8/14刺激RAW264.7细胞,采用液相芯片技术和实时荧光定量PCR(q PCR)技... 详细信息

目的:探讨PDE4抑制剂咯利普兰抑制髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7中促炎性因子释放的刺激作用,并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法:MRP8/14刺激RAW264.7细胞,采用液相芯片技术和实时荧光定量PCR(q PCR)技术分别检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的蛋白和mRNA水平;咯利普兰预处理RAW264.7细胞后,MRP8/14刺激细胞,采用液相芯片技术和q PCR技术分别检测TNF-α和IL-6的蛋白水平和mRNA水平;Western blot法检测NF-κB P65蛋白磷酸化水平;间接免疫荧光法检测RAW264.7细胞内NF-κB P65蛋白核移位情况。结果:液相芯片及q PCR结果显示MRP8/14具有很强的促炎性因子TNF-α和IL-6释放的作用(P<0.01),而咯利普兰可以显著减弱MRP8/14促炎性因子释放的作用(P<0.05)。此外,MRP8/14能够诱导NF-κB P65蛋白发生磷酸化,胞核中P65蛋白增加;而咯利普兰显著减弱NF-κB P65蛋白磷酸化(P<0.05)。结论:咯利普兰可能通过NF-κB途径显著减弱MRP8/14的促炎作用。

关键词：急性肺损伤咯利普兰髓样相关蛋白8/14 炎性因子核因子κB

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基于甲基化反应系统检测SETD3甲基化组蛋白的位点

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生物技术 2017年第3期27卷 245-251页

作者：钟玙沄黄梦怡孙江黄穗李月罗海华姜勇刘靖华广东省功能蛋白质组学重点实验室南方医科大学基础医学院病理生理学教研室广东广州510515

[目的]构建pEGX-4T-1-Setd3,表达并纯化GST-SETD3蛋白;用获得的蛋白进行体外甲基化反应并鉴定其活性,建立体外甲基化反应系统。[方法]PCR扩增小鼠全长Setd3,插入到pEGX-4T-1载体获得pEGX-4T-1-Setd3质粒。将质粒转化大肠杆菌,用异丙基-... 详细信息

[目的]构建pEGX-4T-1-Setd3,表达并纯化GST-SETD3蛋白;用获得的蛋白进行体外甲基化反应并鉴定其活性,建立体外甲基化反应系统。[方法]PCR扩增小鼠全长Setd3,插入到pEGX-4T-1载体获得pEGX-4T-1-Setd3质粒。将质粒转化大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-SETD3蛋白并进行纯化。将获得的GST-SETD3蛋白定量后进行体外组蛋白甲基化反应,用Western Blot检测GST-SETD3对组蛋白H3K4及H3K36的甲基化情况。[结果]p GEX-4T-1-Setd3质粒构建正确,纯化的GST-SETD3蛋白纯度较高;甲基化反应结果表明,用不同来源的组蛋白、反应时间、反应缓冲液及检测方法均检测不到GST-SETD3二甲基化H3K4;GSTSETD3可以二甲基化H3K36。[结论]成功表达和纯化GST-SETD3蛋白;该蛋白可以使H3K36发生二甲基化,但不能使H3K4二甲基化。成功构建体外甲基化反应系统。

关键词： GST-SETD3 重组蛋白原核表达蛋白纯化甲基化反应甲基转移酶

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NFKBIA 3＇UTR功能鉴定及相互作用蛋白的蛋白质组学筛选

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生物技术 2017年第2期27卷 154-160页

作者：王静李涛欧小利姜勇梅柱中南方医科大学基础医学院病理学与病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

[目的]鉴定NFKBIA基因3'非翻译区功能并筛选与其相互作用的蛋白质。[方法](1)PCR扩增获得luciferaseNFKBIA 3'非翻译区融合片段并克隆至p GL3-control载体中获得重组质粒p GL3-NF,转染NIH3T3细胞24h后回收细胞检测荧光素酶活性... 详细信息

[目的]鉴定NFKBIA基因3'非翻译区功能并筛选与其相互作用的蛋白质。[方法](1)PCR扩增获得luciferaseNFKBIA 3'非翻译区融合片段并克隆至p GL3-control载体中获得重组质粒p GL3-NF,转染NIH3T3细胞24h后回收细胞检测荧光素酶活性。(2)制备生物素标记的NFKBIA 3'非翻译区RNA探针,通过链亲和素-生物素RNA-pull down获得与其相互结合的蛋白质并进行质谱鉴定。[结果](1)NFKBIA 3'非翻译区能显著性降低与其相连的荧光素酶基因的表达(p<0.001)。(2)质谱鉴定得到Myosin9等24种与NFKBIA 3'非翻译区相互作用的蛋白质。[结论]NFKBIA基因3'非翻译区对与其相连的基因的表达起负调控作用。与NFKBIA基因3'非翻译区相互结合的24种蛋白质之间存在直接或间接的相互作用。

关键词：核因子"B NFKBIA mRNA 3'非翻译区 RNA结合蛋白质谱

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不稳定型心绞痛患者血浆蛋白标记物的蛋白质组学筛选

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解放军医学杂志 2017年第6期42卷 532-537页

作者：胡水旺沈安娜郑德仲黄敬胡兆霆南方医科大学病理生理学教研室、广东省蛋白质组学重点实验室广州510515 南方医科大学第三附属医院心血管内科广州510630 南方医科大学第三附属医院检验科广州510630

目的分析冠心病不稳定型心绞痛(UAP)与稳定型心绞痛(SAP)患者血浆中的差异蛋白质,筛选可能与UAP早期诊断密切相关的血浆蛋白标记物。方法分别收集2014年6月-2015年4月南方医科大学第三附属医院UAP及SAP血浆标本各60例,另收集体检科收集... 详细信息

目的分析冠心病不稳定型心绞痛(UAP)与稳定型心绞痛(SAP)患者血浆中的差异蛋白质,筛选可能与UAP早期诊断密切相关的血浆蛋白标记物。方法分别收集2014年6月-2015年4月南方医科大学第三附属医院UAP及SAP血浆标本各60例,另收集体检科收集的血浆标本作为正常对照组(n=60)。随机取对照组(n=10)、UAP组(n=10)与SAP组(n=10)空腹血浆标本各100μl,分别等量混合成3组样本,去除血浆高丰度蛋白后,利用双向差异凝胶电泳(DIGE)技术进行蛋白分离,经差异软件分析后,采集UAP和SAP之间变化2倍以上的差异蛋白质点,利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间/飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)对差异蛋白点进行鉴定。每组随机选取40份血浆样本,选取UAP特异性差异蛋白进行ELISA验证。结果 UAP与SAP组患者血浆相比较,共筛选出10个表达量差异2倍以上的差异蛋白点,包括9个上调蛋白点,1个下调蛋白点。经质谱鉴定后,表达上调的蛋白包括纤维蛋白原γ链(FGG)、补体C4-B(C4B)、免疫球蛋白κ链C结构域(IGKC)和血红蛋白α亚基(HBA1);表达下调的蛋白是结合珠蛋白(HP)。与对照组比较后,在这些差异蛋白中共找到2个UAP特异性相关蛋白,即IGKC和HP。选取IGKC进行ELISA验证,结果表明,与对照组和SAP组相比较,UAP组样本中IGKC特异性表达上调(P<0.05),与DIGE验证结果一致。结论筛选到UAP特异性相关蛋白IGKC和HP,IGKC有可能成为UAP早期筛查及诊断的特异性生物标记物。

关键词：心绞痛,不稳定型血浆生物学标记蛋白质组学双向差异凝胶电泳

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SETD4基因敲除小鼠的构建及鉴定

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中国临床解剖学杂志 2016年第2期34卷 202-207页

作者：黄穗黄梦怡钟玙沄雷烨铭赵舒祺蔡军伟姜勇刘靖华广东省蛋白质组学重点实验室南方医科大学病理生理学教研室广州510515

目的构建并鉴定SETD4基因敲除小鼠,为研究SETD4的生物学功能提供动物模型。方法将引进的SETD4flox/+小鼠与EIIa-Cre小鼠进行杂交繁殖,得到基因型为SETD4+/-.EIIa-Cre的小鼠;再与C57BL/6小鼠杂交去除Cre酶,获得杂合子SETD4+/-小鼠;该小... 详细信息

目的构建并鉴定SETD4基因敲除小鼠,为研究SETD4的生物学功能提供动物模型。方法将引进的SETD4flox/+小鼠与EIIa-Cre小鼠进行杂交繁殖,得到基因型为SETD4+/-.EIIa-Cre的小鼠;再与C57BL/6小鼠杂交去除Cre酶,获得杂合子SETD4+/-小鼠;该小鼠自交获得纯合子SETD4-/-小鼠。通过PCR法鉴定子代小鼠的基因型;RT-PCR、荧光定量PCR方法鉴定纯合子的SETD4基因敲除小鼠SETD4m RNA表达情况;HE染色观察小鼠肝、肺组织的形态学变化。结果 PCR结果表明子代小鼠的基因型符合SETD4-/-;纯合子基因敲除小鼠SETD4 m RNA水平显著低于野生型小鼠;SETD4基因敲除小鼠肝、肺组织的形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异。结论本研究基于Cre/loxp系统,成功构建并鉴定了SETD4基因敲除小鼠。

关键词： SETD4 基因敲除 Cre/loxp系统 KO-First技术

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Prdx4蛋白表达改变对HeLa细胞迁移和侵袭的影响

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中国病理生理杂志 2016年第4期32卷 637-643页

作者：袁伟燕张丽石红琴龚小卫姜勇南方医科大学病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的:观察过氧化物还原酶4(peroxiredoxin 4,Prdx4)蛋白表达的改变对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响。方法:采用脂质体瞬时转染法将表达质粒pc DNA3.0-HA-Prdx4转染HeLa细胞;LV-Prdx4 RNAi重组病毒感染HeLa细胞,构建Prdx4 shRNA HeL... 详细信息

目的:观察过氧化物还原酶4(peroxiredoxin 4,Prdx4)蛋白表达的改变对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响。方法:采用脂质体瞬时转染法将表达质粒pc DNA3.0-HA-Prdx4转染HeLa细胞;LV-Prdx4 RNAi重组病毒感染HeLa细胞,构建Prdx4 shRNA HeLa细胞系沉默Prdx4的表达;用蛋白质印迹法证实Prdx4蛋白表达水平的变化;应用划痕愈合实验和Transwell迁移及侵袭实验分别检测细胞迁移及侵袭能力的变化。结果:pc DNA3.0-HA-Prdx4质粒转染组He La细胞的Prdx4蛋白表达水平明显上调(P<0.05),而Prdx4 shRNA HeLa稳定干扰细胞系Prdx4表达水平明显下调(P<0.05)。Prdx4过表达组HeLa细胞的迁移和侵袭能力明显增强,与空白对照组及空载体转染组比较,差异显著(P<0.01)。Prdx4表达干扰组HeLa细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制,与空白对照组及阴性对照组比较,差异显著(P<0.01)。结论:上调Prdx4蛋白表达水平可促进HeLa细胞的迁移和侵袭,在宫颈癌的发生和发展过程中可能起重要作用;下调Prdx4蛋白表达水平可以明显抑制HeLa细胞的迁移和侵袭能力,Prdx4有可能成为临床治疗宫颈癌的一个潜在靶点。

关键词：宫颈癌过氧化物还原酶4 细胞迁移细胞侵袭

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Rab7蛋白参与了BLP耐受巨噬细胞对细菌清除能力增强的过程

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中国病理生理杂志 2016年第5期32卷 900-906页

作者：赵舒祺蔡军伟李雪杨勤黄林罗海华项静乔敏姜勇刘靖华贵州医科大学病理生理学教研室贵州贵阳550004 南方医科大学基础医学院病理生理学教研室广东省蛋白质组学重点实验室广东广州510515

目的:探讨Rab GTP酶是否参与了对细菌脂蛋白(BLP)耐受的骨髓诱导分化巨噬细胞(BMDMs)杀菌能力增强的过程。方法:首先利用real-time PCR比较BLP耐受巨噬细胞和非耐受细胞中Rab5a、Rab5b、Rab7、Rab9、Rab9b、Rab11a、Rab11b、Rab12、Rab3... 详细信息

目的:探讨Rab GTP酶是否参与了对细菌脂蛋白(BLP)耐受的骨髓诱导分化巨噬细胞(BMDMs)杀菌能力增强的过程。方法:首先利用real-time PCR比较BLP耐受巨噬细胞和非耐受细胞中Rab5a、Rab5b、Rab7、Rab9、Rab9b、Rab11a、Rab11b、Rab12、Rab32和Rab34的表达变化,筛选出水平升高的Rab7分子;进一步用real-time PCR和Western blot实验证实Rab7的mRNA和蛋白表达是否在BLP耐受细胞感染大肠杆菌后继续升高;接下来用RNAi技术下调BLP耐受巨噬细胞Rab7表达,观察细胞对细菌的吞噬能力及杀灭能力的影响。结果:在检测的10个Rab GTP酶中,Rab7在BLP耐受BMDMs的mRNA水平升高,是非耐受细胞的1.4倍;进一步用real-time PCR和Western blot实验证实Rab7的mRNA和蛋白表达在BLP耐受细胞感染大肠杆菌后,随着时间延长均明显升高;下调Rab7表达不影响BLP耐受巨噬细胞对细菌的吞噬能力,但是显著降低其对细菌的杀灭能力。结论:BLP耐受通过上调巨噬细胞Rab7的表达,在增强巨噬细胞对细菌的杀灭过程中发挥重要作用。

关键词：细菌脂蛋白耐受细菌清除 Rab GTP酶 Rab7蛋白

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