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第十二届全国红细胞疾病(贫血)学术会议

作者：严提珍徐湘民南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室

地中海贫血(地贫)是世界上最常见的单基因遗传病之一，通过产前诊断淘汰受累重型患儿是目前世界上公认的地贫首选预防措施。母血浆胎儿游离核酸的发现为地贫的无创性产前诊断提供了新的途径。近些年来，针对地贫遗传缺陷(特别是(a)地贫... 详细信息

地中海贫血(地贫)是世界上最常见的单基因遗传病之一，通过产前诊断淘汰受累重型患儿是目前世界上公认的地贫首选预防措施。母血浆胎儿游离核酸的发现为地贫的无创性产前诊断提供了新的途径。近些年来，针对地贫遗传缺陷(特别是(a)地贫点突变)的母血浆胎儿游离DNA检测技术，如飞行时间质谱分析、分子大小分离法、肽核酸介导的突变序列富集方法和数字化PCR等技术的发展使开展地贫的无创性产前诊断成为现实，这些技术的进一步发展有望推动无创性产前诊断在其他人类单基因病上的应用。本文在重点阐述与地贫相关的研究外，也对该领域技术发展和应用的整体现状进行了综述。产前诊断(prenatal diagnosis)是现代产科服务的有机组成部分，其内含为在胎儿出生前通过遗传学分析或影像学检测对胎儿的某些特定疾病进行医学诊断。影像学检测主要检测胎儿发育的大体结构是否有畸形，遗传学检测广泛用于人类遗传性疾病和遗传特性(如性别和血型等)的诊断，后者依据胎儿取材方法的不同，分为创伤性和无创性诊断两种。无创性产前诊断(noninvasive prenatal diagnosis，NIPD)是不同于羊膜腔穿刺、绒毛取样和脐血取样等传统创伤性方法的现代技术，主要指母体外周血中胎儿细胞(fetal cell)和游离胎儿核酸(cell free fetal nucleic acid，cffNA)采样和分析技术。影像学检测也属无创性产前诊断的范畴，本文主要介绍遗传学检测中基于母体外周血中胎儿核酸分析的产前诊断。母体外周血中胎儿细胞(有核红细胞)的发现历史最早可以追朔到19世纪70年代，但直到上世纪60年代末，Walknowska等在孕妇外周血中鉴定出男胎的滋养层细胞时才首次证实了母体外周血中存在胎儿细胞的事实[1]。此后至今，母体外周血中胎儿有核红细胞(nucleated red blood cell，NRBC)的研究一直是该技术领域关注的重点，但由于母体血液中胎儿细胞的含量极少(占母血细胞的1/109～105)，其分离和检测技术的复杂性使这一无创性胎儿诊断方法的临床实践和应用受到很大的限制。1997年LoYM等采用快速煮沸法抽提孕妇血清和血浆中的DNA，并用Y染色体特异性PCR进行胎儿性别诊断，从而首次证明孕妇外周血中存在游离胎儿DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)，这一重要发现开辟了无创性产前诊断的新途径。随后，LoYM所领导的课题组于2000年又证实了母体血循环中存在来源于胎盘的游离胎儿mRNA(cell free fetal RNA，cffRNA)的事实，为母体血中胎儿核酸分析技术的广泛应用奠定了研究基础。目前这一无创性胎儿产前诊断技术已在胎儿性别鉴定、RHD血型分析和非整倍体染色体的诊断等领域得以应用。由于在cffDNA中检测导致人类遗传病的基因突变十分困难，故其在人类单基因病上的临床应用，特别是作为常规技术应用尚需假以时日。针对人类单基因病点突变的分子诊断方法学探索是该领域技术应用的关键，本文将围绕地中海贫血这一代表性人类遗传病的母体血浆(血清)胎儿核酸分析技术的方法学和无创性胎儿产前诊断在人类遗传病的临床应用前景展开阐述。

关键词：地中海贫血产前诊断母体外周血核酸分析

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脊髓性肌萎缩症的基因诊断及其应用研究

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中华医学遗传学杂志 2009年第3期26卷 306-309页

作者：曹东华任梅宏林长坤崔婉婷麻宏伟武盈玉金春莲中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室沈阳110001 中国人民解放军第二0二医院检验科中国医科大学附属第二临床医院发育儿科

目的对脊髓性肌萎缩症患者及携带者进行基因诊断和产前基因诊断。方法对26例脊髓性肌萎缩症患者应用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restiction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术检测SMN1基因第7外显子是否缺失；对于患者... 详细信息

目的对脊髓性肌萎缩症患者及携带者进行基因诊断和产前基因诊断。方法对26例脊髓性肌萎缩症患者应用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-restiction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术检测SMN1基因第7外显子是否缺失；对于患者的父母应用多重PCR结合变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）的方法进行携带者诊断；而既往生产过患儿的孕妇于孕中期抽取羊水，进行产前基因诊断。结果26例脊髓性肌萎缩症患者中查出25例存在SMN1基因第7外显子纯合缺失；患者的父母全部为SMN1基因第7外显子杂合缺失携带者；对20名既往生产过患儿的孕妇进行了产前诊断，8名存在SMN1基因第7外显子纯合缺失。结论PCR—RFLP、多重PCR结合DHPLC技术可应用于患者及携带者基因诊断；PCR—RFLP可用于脊髓性肌萎缩症的产前基因诊断。

关键词：多重PCR 变性高效液相色谱脊髓性肌萎缩症运动神经元生存基因

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BAX对Hep2细胞系的凋亡及化疗敏感性的影响

BAX对Hep2细胞系的凋亡及化疗敏感性的影响

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东北三省及内蒙古地区遗传学研究进展学术研讨会

作者：刘佳符爽杨敏郭艳孙开来富伟能中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室

目的研究BAX对人喉鳞状细胞癌Hep2细胞系凋亡和对化疗药5-氮杂-2:脱氧胞苷(5-aza-2'-de- oxycitydine,5-Aza-CdR)敏感性的影响。方法通过溴化二甲噻唑二苯四氨唑(MTT)比色法检测5-Aza-CdR对Hep2细胞体外增值的影响。将BAX基因转入H... 详细信息

目的研究BAX对人喉鳞状细胞癌Hep2细胞系凋亡和对化疗药5-氮杂-2:脱氧胞苷(5-aza-2'-de- oxycitydine,5-Aza-CdR)敏感性的影响。方法通过溴化二甲噻唑二苯四氨唑(MTT)比色法检测5-Aza-CdR对Hep2细胞体外增值的影响。将BAX基因转入Hep2细胞后,应用RT-PCR法和流式细胞术分别检测BAX在Hep2细胞中的表达和Hep2细胞凋亡及细胞周期变化。结果5-Aza-CdR能抑制hep2细胞体外生长, BAX和5-Aza-CdR使Hep2细胞发生G1/S期细胞阻滞。RT-PCR显示转染BAX基因的Hep2细胞中BAX表达显著增加,转染BAX基因及加药组细胞凋亡率明显增加。结论转染BAX基因能诱导Hep2细胞的凋亡,并能增加Hep2细胞对药物5-Aza-CdR杀伤作用的敏感性。

关键词：喉癌 BAX 细胞凋亡 5-Aza-CdR

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脂联素基因单核苷酸多态性与2型糖尿病研究现况

脂联素基因单核苷酸多态性与2型糖尿病研究现况

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东北三省及内蒙古地区遗传学研究进展学术研讨会

作者：杨翠红杨康鹃延边大学延边大学医学部基础医学院医学遗传学教研室

脂联素(adipocyte-specific,apM-1)是新近发现的由脂肪组织特异性分泌的激素蛋白质。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是由于胰岛素抵抗或胰岛素分泌相对不足而导致慢性高血糖的一种常见的具有明显异质性的多基因遗传病,又称... 详细信息

脂联素(adipocyte-specific,apM-1)是新近发现的由脂肪组织特异性分泌的激素蛋白质。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是由于胰岛素抵抗或胰岛素分泌相对不足而导致慢性高血糖的一种常见的具有明显异质性的多基因遗传病,又称为复杂性疾病(complex disease)。近来研究证实,肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病(T2DM)患者apM-1水平较正常人群为低。研究发现apM-1基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymoiphisms,SNPs)对体质指数、血糖、血脂、血压等代谢综合征产生一定影响,可能与T2DM等疾病的发生有关。本文就脂联素SNPs与脂联素血清水平与胰岛素抵抗与2型糖尿病的发生、并发症及其他疾病的发生相关性进行综述。

关键词：脂联素 2型糖尿病胰岛素抵抗血清脂联素水平单核苷酸多态性

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喉癌相关MTLC基因启动子的结构与功能分析

喉癌相关MTLC基因启动子的结构与功能分析

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东北三省及内蒙古地区遗传学研究进展学术研讨会

作者：符爽刘佳杨敏郭艳孙开来富伟能中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室

目的探讨喉癌相关新基因MTLC(C-MYC targetfrom laryngeal cancer)基因启动子的结构及其功能。方法应用生物信息学软件对MTLC基因的启动子区域进行分析,以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增方法获得P708(-708～+155bp)、P655(-655～+155... 详细信息

目的探讨喉癌相关新基因MTLC(C-MYC targetfrom laryngeal cancer)基因启动子的结构及其功能。方法应用生物信息学软件对MTLC基因的启动子区域进行分析,以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增方法获得P708(-708～+155bp)、P655(-655～+155bp)、P523(-523～+155bp)三段不同长度的启动子片段,将其定向克隆入pGL3Basic载体,构建荧光素酶报告基因表达载体,瞬时转染喉癌Hep2细胞系和人胚肾HEK293细胞系,并采用凝胶电泳迁移实验和染色质免疫共沉淀实验验证MTLC基因启动子的功能活性。结果发现在两个细胞系中P523几乎没有荧光素酶活性,而P708、P655存在明显的荧光素酶活性,表明启动子区位于ATG上游-708～-523bp区域,凝胶电泳迁移实验和染色质免疫共沉淀实验表明该区域能特异性的与转录因子C-MYC结合。结论成功克隆了具有活性的MTLC启动子序列,C-MYC为其重要的转录因子,为研究MTLC基因的转录调控机制奠定了实验基础。

关键词： MTLC 启动子报告基因 C-MYC 喉癌

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BAX对Hep2细胞系的凋亡及化疗敏感性的影响

BAX对Hep2细胞系的凋亡及化疗敏感性的影响

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第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)

作者：刘佳郭艳孙开来富伟能中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室

目的研究BAX对人喉鳞状细胞癌Hep2细胞系凋亡和对化疗药5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycitydine,5-Aza-CdR)敏感性的影响。方法通过溴化二甲噻唑二苯四氨唑(MTT)比色法检测5-Aza-CdR对Hep2细胞体外增值的影响。将BAX基因转入Hep2... 详细信息

目的研究BAX对人喉鳞状细胞癌Hep2细胞系凋亡和对化疗药5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycitydine,5-Aza-CdR)敏感性的影响。方法通过溴化二甲噻唑二苯四氨唑(MTT)比色法检测5-Aza-CdR对Hep2细胞体外增值的影响。将BAX基因转入Hep2细胞后,应用RT-PCR法和流式细胞术分别检测BAX在Hep2细胞中的表达和Hep2细胞凋亡及细胞周期变化。结果5-Aza-CdR能抑制hep2细胞体外生长,BAX和5-Aza-CdR使Hep2细胞发生G1/S期细胞阻滞。RT-PCR显示转染BAX基因的Hep2细胞中BAX表达显著增加,转染BAX基因及加药组细胞凋亡率明显增加。结论转染BAX基因能诱导Hep2细胞的凋亡,并能增加Hep2细胞对药物5-Aza-CdR杀伤作用的敏感性。

关键词：喉癌 BAX 细胞凋亡 5-Aza-CdR

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iNOS基因调控区-1026C/A多态的功能研究

iNOS基因调控区-1026C/A多态的功能研究

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第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)

作者：李伟赵彦艳中国医科大学医学基础医学院医学遗传学教研室

目的和方法iNOS基因启动子是目前发现的最复杂的基因启动子之一,该基因启动子在生理条件下处于沉默状态,当细菌脂多糖和细胞因子等因素刺激才启动调节iNOS的表达。目前,iNOS基因启动子中有许多调控元件已经被发现,但由于其启动子的复杂... 详细信息

目的和方法iNOS基因启动子是目前发现的最复杂的基因启动子之一,该基因启动子在生理条件下处于沉默状态,当细菌脂多糖和细胞因子等因素刺激才启动调节iNOS的表达。目前,iNOS基因启动子中有许多调控元件已经被发现,但由于其启动子的复杂性仍有待不断发掘和鉴定新的启动子元件。在前期工作中发现该基因启动子区中-1026C/A位点与原发性高血压发生存在关联性,通过软件预测到-1026C位点存在转录因子YY1的结合位点,并发现转录因子YY1通过与iNOS- 1026C的结合,使iNOS基因启动子转录活性下降。为了进一步研究YY1转录因子对于iNOS基因启动子转录活性的影响,本实验运用了含有-1026C/A位点的不同等位基因萤光素酶报告基因重组体和含有YY1编码序列的真核表达载体,通过瞬时共转染细胞,检测外源转入YY1后对于含有-1026C/A位点的不同等位基因的启动子的转录活性,以进一步明确YY1转录因子在iNOS基因转录调控中的作用。由于YY1的转录调节活性主要受到乙酰化和去乙酰化的调节,YY1乙酰化后其转录抑制活性可能增强,因此本研究在上述实验过程中添加去乙酰化酶抑制剂为影响因素,进一步观察启动子活性的变化。结果实验结果显示,外源转入YY1能明显抑制含有-1026C/A位点的iNOS启动子片段的转录活性。去乙酰化酶的抑制剂可抑制去乙酰化酶活性,增加YY1的乙酰化水平,从而使YY1进一步抑制iNOS启动子片段的转录活性。

关键词： iNOS YY1

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高血压易感基因CYP4F2转基因小鼠模型的建立

高血压易感基因CYP4F2转基因小鼠模型的建立

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第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)

作者：刘晓亮赵彦艳中国医科大学医学基础医学院医学遗传学教研室

细胞色素P450 4F2(CYP4F2)通过ω-羟化作用将花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代谢为20-羟二十碳四烯酸(20- hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE),是人类肾脏产生20-HETE最主要的酶,20-HETE具有收缩血管和调节离子稳态的重要作用,CYP4F2因而是原发性高血压的重要候选基因之一。本课题组前期研究已证明CYP4F2基因调控区SNP与高血压表型相关,为进一步研究其在高血压发生发展中的作用,本研究首次建立了人CYP4F2转基因小鼠模型。肾脏雄激素调节蛋白(kidney androgen-regulated protein,KAP)是小鼠肾脏近端小管呈雄激素反应性表达的高丰度蛋白,选择KAP启动子异源性驱动CYP4F2在转基因小鼠肾脏高表达,将为实现CYP4F2的可调节诱导表达提供条件。首先构建KAP-LUC报告基因表达载体,通过体外培养细胞转染实验证明KAP启动子能够驱动荧光素酶报告基因的表达。以CYP4F2 cDNA替换LUC构建KAP- CYP4F2表达载体,验证KAP启动子能够驱动CYP4F2在转染细胞中高表达。然后将已验证的转基因表达载体KAP-CYP4F2线性化,通过显微注射技术,建立CYP4F2转基因小鼠模型。通过PCR及Southern blot双重鉴定了转基因阳性小鼠的基因型。Western blot结果表明CYP4F2在转基因小鼠肾脏呈现高表达,雄性肾脏表达明显高于雌性,此外性激素反应性器官(睾丸、附睾或子宫、卵巢)表达明显。免疫组化进一步将肾脏的CYP4F2表达定位于肾单位的近端小管。ELISA方法提示CYP4F2过表达显著提高了转基因小鼠尿20-HETE的水平(p<0.05),对小鼠的血压测量显示与对照组相比,转基因小鼠血压明显升高(p<0.05)。本研究成功建立了人CYP4F2转基因小鼠模型,CYP4F2在转基因小鼠的肾脏近端小管高表达,并呈现雄激素反应性表达特点,CYP4F2转基因小鼠20-HETE的产生显著升高,并引发了高血压表型。

关键词： CYP4F2 20-HETE 转基因肾脏高血压

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p300催化的NF-kB乙酰化在nNOS基因转录调控中的作用

p300催化的NF-kB乙酰化在nNOS基因转录调控中的作用

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第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)

作者：李英慧赵彦艳中国医科大学医学基础医学院医学遗传学教研室

一氧化氮(NO)对维持神经系统的正常功能至关重要。NO由三种一氧化氮合酶(NOS)催化合成,包括神经型(nNOS)、诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS),其中nNOS在神经系统的NO合成中发挥最为重要的作用。细胞nNOS水平受其基因转录活性的动态调节。我... 详细信息

一氧化氮(NO)对维持神经系统的正常功能至关重要。NO由三种一氧化氮合酶(NOS)催化合成,包括神经型(nNOS)、诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS),其中nNOS在神经系统的NO合成中发挥最为重要的作用。细胞nNOS水平受其基因转录活性的动态调节。我们已在nNOS基因启动子区鉴定了一个核因子(NF)-κB反应元件,证明了NF-κB的乙酰化可通过该元件调节nNOS基因转录。目的进一步鉴定NF-κB乙酰化的调节机制及其在nNOS基因转录中的作用。方法以人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞为研究对象,应用免疫共沉淀(CoIP)鉴定一种组蛋白乙酰转移酶(HAT)p300与NF-κB p65和p50亚基的相互作用;应用染色质免疫沉淀(ChIP)鉴定p300与nNOS启动子NF-κB反应元件区域的结合;免疫沉淀结合Western blot方法检测p300对NF-κB乙酰化水平的调节;萤光素酶报告基因活性检测p300对nNOS启动子活性的影响。结果CoIP结果显示SK-N-SH细胞中存在p300与NF-κB的相互作用;ChIP结果提示p300可结合于nNOS启动子NF-κB反应元件区域;同时p300可诱导NF-κB p65和p50亚基的乙酰化,而该作用依赖于p300的HAT结构域;萤光素酶报告基因检测结果提示p300可通过NF-κB反应元件的作用上调nNOS启动子转录活性。结论p300可乙酰化NF-κB p65和p50亚基,进而通过nNOS启动子区NF-κB反应元件调节nNOS启动子转录活性,这可能是神经系统中nNOS基因的一种重要的转录调节机制。

关键词：启动子基因转录调控 NF-kB 乙酰化

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马凡氏综合征的基因突变筛查及其应用研究

马凡氏综合征的基因突变筛查及其应用研究

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第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)

作者：崔婉婷金春莲中国医科大学医学基础医学院医学遗传学教研室

马凡氏综合征是常染色体显形遗传性结缔组织疾病,病变主要涉及骨骼,眼睛,心血管系统,有时也涉及肺部,皮肤和硬脑脊膜等器官。症状主要有主动脉瓣反流,晶状体异位,骨骼过长,和比较严重的新生儿马凡氏综合征。马凡氏综合征主要致死原因为... 详细信息

马凡氏综合征是常染色体显形遗传性结缔组织疾病,病变主要涉及骨骼,眼睛,心血管系统,有时也涉及肺部,皮肤和硬脑脊膜等器官。症状主要有主动脉瓣反流,晶状体异位,骨骼过长,和比较严重的新生儿马凡氏综合征。马凡氏综合征主要致死原因为心血管系统发生病变。马凡氏综合征症状呈现广泛的多样性,很多患者的症状不一定符合诊断标准,而且由于马凡氏综合征的症状是与年龄增长密切相关的,所以许多儿童期的患者并未出现临床症状。因此,马凡氏综合征的基因诊断对于辅助临床诊断非常重要。近些年在基因方面的研究主要认为马凡氏综合征发病原因为原纤维蛋白基因(FBN1)的突变。原纤维蛋白的基因位于15号染色体的长臂上(15q15-q21.1)这段基因长230kb,有65个外显子,可转录为一段长10kb的mRNA,并翻译为2871个氨基酸。目前,所有的FBN1突变都被收录到FBN1 mutation database(http://***:2030/)这个数据库中,可以查到600多种突变,FBN1基因的突变可以发生在整个基因的任意区域,并未发现在任何特别的一个区域突变率较高,大约有12%的突变可以发生重现。在整个F B N1基因中,而没有明显的热点位置。然而,这种分布在少数的区域显示了明显的差别:突变较少的区域是外显子57和外显子65;而突变较多的区域是外显子13、外显子26和外显子27。在FBN1基因突变类型中最常见的是点突变,其中错义突变大致占60%,无义突变大致占10%。在临床基因检测中主要FBN1基因突变进行检测通过对FBN1基因cDNA序列的分析,发现FBN1基因突变率大约为70%到93%,其突变发现率主要受以下几个因素的影响:(1)马凡氏综合征的临床诊断准确性(例如,满足临床诊断标准,并且有家族史的患者更容易筛查出FBN1基因突变)(2)突变类型(3)实验方法检测突变的能力。cDNA序列的筛查通过对FBN1基因cDNA序列的筛查,可以对整个FBN1基因的编码区进行筛查,还可以确定一些剪接位点的突变,而这些突变通过对基因组DNA(genomic DNA,gDNA)序列的分析有时并不能检测出来。应用此方法检测符合临床诊断标准的患者,检出率可高达90%。gDNA的突变筛查应用CSGE,DHPLC,直接测序等方法检测导致RNA快速降解的突变,这些突变通过对cDNA序列的筛查不能检测出来。应用此方法检测符合临床诊断标准的患者,检出率可达70%到93%。目前国内外学者研究主要集中于检测FBN1基因的突变,在中国人群中的突变类型报道很少。本研究通过多种实验方法来检测FBN1基因的突变,并在多个家系中应用单倍型分析FBN1基因的突变。对已检测出突变的患者,可以对其后代进行产前诊断,为马凡氏综合征的产前诊断研究奠定基础。

关键词：马凡氏综合征 FBN1 突变基因检测

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