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四川大学学报（医学版） 2004年第5期35卷 715-718页

作者：何涛李洪李蓉晖段承刚甘淋李娟宋杰泸州医学院基础医学院分子生物学实验室泸州646000 泸州医学院基础医学院生物化学教研室四川大学基础医学与法医学院生物化学教研室

目的　建立一种对神经细胞中的磷酸化蛋白质进行分离分析的方法。方法　培养新生乳小鼠神经细胞 ,加入 32 P- Na H2 PO4 2 .78× 10 6 Bq/ ml,37℃孵育 1.5 h。刺激组分别加入表皮生长因子 (EGF) 2 0 ng/ m l或胰岛素10 0 nm ol/ L... 详细信息

目的　建立一种对神经细胞中的磷酸化蛋白质进行分离分析的方法。方法　培养新生乳小鼠神经细胞 ,加入 32 P- Na H2 PO4 2 .78× 10 6 Bq/ ml,37℃孵育 1.5 h。刺激组分别加入表皮生长因子 (EGF) 2 0 ng/ m l或胰岛素10 0 nm ol/ L,对照组加入等量的培养基 ,作用不同时间后液氮终止反应。裂解细胞 ,用 Bio- Rad DC Protein Assaykit测定细胞蛋白质含量 ,双向电泳分离细胞蛋白。放射自显影。结果　 1双向电泳自显影图谱显示近数十个蛋白质斑点 ,绝大部分集中于 p H偏酸性和中性区域 ,p H4 .6～ 6 .5 ,其相对分子质量主要介于 2 0× 10 3～ 130× 10 3之间。2 EGF、胰岛素刺激不同时间后虽出现有磷酸化蛋白质斑点的增加或消失 ,但更多表现为某些磷酸化蛋白质斑点灰度的增强或减弱。 3对比分析发现 ,放射自显影图谱中只有少数斑点出现在双向电泳 Coom assie Brilliant BlueR- 2 5 0染色图谱中 ,提示神经细胞中的大多数磷酸化蛋白质为低丰度蛋白。结论　采用本研究建立的双向电泳和放射自显影技术可对神经细胞中的蛋白质可逆磷酸化修饰状态进行较为全面、动态的分析 ,方法灵敏、特异性强。

关键词：磷酸化修饰双向电泳放射自显影蛋白质组

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载脂蛋白A1基因rs670和rs5069多态性对不同体质量指数青少年血脂的影响

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中国医学科学院学报 2014年第4期36卷 369-376页

作者：宋永砚龚仁蓉张珍李元昊樊梅欧国进方定志四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041 川北医学院基础医学院生物化学教研室四川南充637007

目的探讨载脂蛋白A1基因(APOA1)rs670和rs5069多态性与不同体质量指数(BMI)健康青少年血脂水平的相关性。方法根据BMI将723名青少年分成4组,从低到高依次为1组[BMI=(17.80±0.75)kg/m2]、2组[BMI=(19.39±0.32)kg/m2]、3组[BMI=... 详细信息

目的探讨载脂蛋白A1基因(APOA1)rs670和rs5069多态性与不同体质量指数(BMI)健康青少年血脂水平的相关性。方法根据BMI将723名青少年分成4组,从低到高依次为1组[BMI=(17.80±0.75)kg/m2]、2组[BMI=(19.39±0.32)kg/m2]、3组[BMI=(20.68±0.43)kg/m2]和4组[BMI=(23.40±2.05)kg/m2]。测定身高、体质量、腰围、臀围、血压、心率、血脂及血糖等指标,计算BMI和腰臀比,提取基因组DNA并采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法对研究群体进行APOA1 rs670和rs5069多态性分型。结果 APOA1 rs670和rs5069多态性不同基因型青少年的身高、体质量、BMI、腰围、臀围、腰臀比、血压、心率、血脂及血糖等指标在1、2和3组中差异均无统计学意义,4组rs670多态性A等位基因携带者的收缩压(P=0.017)和血糖水平(P=0.009)显著高于GG基因型青少年,rs5069多态性T等位基因携带者的身高(P=0.013)、体质量(P=0.011)和臀围(P=0.026)显著高于CC基因型青少年。结论在BMI较高的健康青少年中,APOA1 rs670多态性A等位基因与收缩压和血糖水平相关,降低体质量可能改善A等位基因对收缩压和血糖的增高作用。

关键词：载脂蛋白A1基因体质量指数血脂多态性

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人ppGalNAc-T2的原核表达、纯化及其蓖麻蛋白样结构域的结构预测

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中国生物化学与分子生物学报 2005年第4期21卷 476-481页

作者：金美芳丁向明仇灏吴士良周嘉梁郭向红潘浩苏州大学医学院基础医学系生物化学与分子生物学教研室

多肽∶N乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)是催化O糖基化的起始酶,在O聚糖的形成中起着关键的作用.为更好地研究该家族酶的结构与功能,采用PCR技术从pDONR201T2得到ppGalNAcT2全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pGEX4T1,转化大肠杆菌BL21... 详细信息

多肽∶N乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)是催化O糖基化的起始酶,在O聚糖的形成中起着关键的作用.为更好地研究该家族酶的结构与功能,采用PCR技术从pDONR201T2得到ppGalNAcT2全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pGEX4T1,转化大肠杆菌BL21,获得相应表达产物,用谷胱甘肽S转移酶(GST)亲和层析柱进行纯化,并进行了Western印迹检测和初步的酶活测定.为进一步研究其功能还在结构研究上利用网络结构模拟SWISSMODEL服务器对ppGalNAcT2的蓖麻蛋白样结构域进行结构模拟.成功构建了原核表达载体pGEX4T1T2,获得有效表达和纯化,并初步鉴定了其活性,同时预测了其可能的三维结构和活性位点.

关键词：多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶融合表达谷胱甘肽S-转移酶亲和柱蛋白印迹蓖麻蛋白样结构域结构模拟

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高淀粉膳食诱导高甘油三酯血症大鼠血浆及肝脏磷脂含量变化的研究

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四川大学学报（医学版） 2007年第1期38卷 129-131页

作者：刘威方定志四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的研究高淀粉膳食诱导高甘油三酯血症(HTG)大鼠血浆及肝脏磷脂(PL)含量的变化。方法实验组大鼠喂饲高淀粉膳食,6 d后氧化酶法测定血浆甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、血糖,抗坏血酸还原法测定PL含量。磷钨酸沉淀法分离高密度脂蛋白(HDL),... 详细信息

目的研究高淀粉膳食诱导高甘油三酯血症(HTG)大鼠血浆及肝脏磷脂(PL)含量的变化。方法实验组大鼠喂饲高淀粉膳食,6 d后氧化酶法测定血浆甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、血糖,抗坏血酸还原法测定PL含量。磷钨酸沉淀法分离高密度脂蛋白(HDL),测定HDL-TG、HDL-C、HDL-PL,计算NHDL-TG、NHDL-C和NHDL-PL浓度。结果实验组大鼠较普通膳食喂饲的对照组血糖、TG、NHDL-TG、PL升高(P<0.05),血浆HDL-C、HDL-PL浓度和HDL-PL/HDL-C比值降低(P<0.05)。实验组大鼠肝脏TG、PL含量升高(P<0.05)。相关性分析发现,实验组血浆PL与TG呈正相关,与HDL-PL呈负相关,与NHDL-TG正相关性较对照组增强(P<0.05);实验组HDL-PL与血糖、血浆PL、肝脏PL呈负相关,与TG、NHDL-TG负相关性较对照组增强(P<0.05);实验组肝脏PL与肝脏TG相关性较对照组增强(P<0.05)。结论高淀粉膳食诱导HTG模型大鼠伴血浆及肝脏PL含量增加,HDL中PL含量减少,血浆及肝脏PL含量与其他脂质含量的相关性状态也发生改变。

关键词：甘油三酯高甘油三酯血症磷脂脂蛋白肝脏

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重组人睾丸精子结合蛋白对蛋白激酶A活性的影响

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生物医学工程学杂志 2007年第6期24卷 1334-1337,1342页

作者：宿文辉张哲张杰于秉治中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室沈阳110001

为探讨人睾丸精子结合蛋白(TSBP)在精子获能及顶体反应中可能发挥的作用,检测了TSBP重组蛋白在体外转染细胞系中对蛋白激酶A活性的影响。构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)B/tsbp,稳定转染HEK293细胞后,蛋白免疫印迹检测到培养细胞... 详细信息

为探讨人睾丸精子结合蛋白(TSBP)在精子获能及顶体反应中可能发挥的作用,检测了TSBP重组蛋白在体外转染细胞系中对蛋白激酶A活性的影响。构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)B/tsbp,稳定转染HEK293细胞后,蛋白免疫印迹检测到培养细胞中融合蛋白的表达。选择表达量高的细胞克隆,扩增并用金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6-TSBP。用放射自显影法检测HEK293细胞中蛋白激酶A(PKA)活性,发现重组质粒转染组PKA活性高于对照组,确定了TSBP对PKA活性的促进作用。

关键词：人睾丸精子结合蛋白蛋白纯化蛋白激酶A

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人肝脏高凝状态相关基因的筛选

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四川大学学报（医学版） 2005年第5期36卷 605-608页

作者：崔晓燕汤慧方定志刘秉文四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的筛选人肝脏高凝状态(PTS)相关基因的全长cDNA序列。方法采用差异筛选法对本室建立的PTS大鼠肝脏差异表达基因消减cDNA文库进行筛选;以获得的差异cDNA克隆为模板,采用PCR方法扩增目的片段;以PCR产物作探针,用噬菌斑原位杂交法筛选人... 详细信息

目的筛选人肝脏高凝状态(PTS)相关基因的全长cDNA序列。方法采用差异筛选法对本室建立的PTS大鼠肝脏差异表达基因消减cDNA文库进行筛选;以获得的差异cDNA克隆为模板,采用PCR方法扩增目的片段;以PCR产物作探针,用噬菌斑原位杂交法筛选人肝脏cDNA文库,经初筛、二筛和三筛后,将获得的阳性克隆转入***25.8,使λTripIEx环化成质粒pTripIEx,经酶切鉴定后进行DNA测序。结果从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条全长cDNA序列,经序列测定及生物信息学分析发现,其中3条的表达产物分别为纤维蛋白原、纤维蛋白原相关蛋白、10号染色体开放阅读框架104mRNA;另1条与氨基甲酰磷酸合成酶1同源。结论以PTS大鼠肝脏差异表达基因cDNA为探针,从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条PTS相关cDNA全长序列。

关键词：差异表达基因 cDNA文库高凝状态肝脏

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MicroRNA-34a调控细胞衰老的研究

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四川大学学报（医学版） 2013年第1期44卷 1-5页

作者：杨鸣鸣范雪娇杜文婷任鹏亮刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的探讨微RNA-34a(miRNA-34a)对细胞通过调控沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)的表达,从而引起细胞衰老的作用。方法构建pre-miRNA-34a表达载体,并将其和一个不针对任何基因的微小RNA-1792(miRNA-1792)表达载体(其他实验室赠送... 详细信息

目的探讨微RNA-34a(miRNA-34a)对细胞通过调控沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)的表达,从而引起细胞衰老的作用。方法构建pre-miRNA-34a表达载体,并将其和一个不针对任何基因的微小RNA-1792(miRNA-1792)表达载体(其他实验室赠送)分别转染至HEK293和HUVEC细胞内,用RT-PCR、Western blot检测各细胞组SIRT1mRNA与蛋白表达水平,以未转染的细胞为对照;将HUVEC细胞分为转染不同质粒、未转染质粒和用SIRT1激活剂白藜芦醇(终浓度1μmol/L,作用2h)处理HUVEC细胞(HUVEC-Res)组,中性彗星电泳分析H2O2作用2h后4组HUVEC细胞的双链损伤情况;用阿霉素处理上述4组HUVEC细胞2h,β-半乳糖甘酶(SA-β-gal)染色检测各细胞不同时间点的衰老情况。结果测序结果表明pre-miRNA-34a表达载体构建成功;RT-PCR、Western blot显示HEK293-pre-miRNA-34a和HUVEC-pre-miRNA-34a中SIRT1mRNA和蛋白质表达的水平明显下降(P<0.001);中性彗星电泳检测发现经H2O2处理后,HUVEC-Res组DNA损伤最轻,而HUVEC-miRNA-34a组DNA损伤程度最为严重;SA-β-gal染色显示DNA损伤后HUVEC-miRNA-34a衰老程度较其它3组严重,而HUVEC-Res组的衰老程度最为轻微。结论 miRNA-34a通过抑制SIRT1表达调控细胞衰老。

关键词： miRNA-34a SIRT1细胞衰老DNA损伤

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中药成分CDP抑制肿瘤细胞生长及其去甲基化作用的研究

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四川大学学报（医学版） 2005年第6期36卷 834-838页

作者：栾菊覃扬徐丹孙芝琳孙泽芳四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的探讨中药成分CDP对肿瘤细胞系的生长抑制作用及其对抑癌基因p 16启动子区CpG岛的去甲基化作用。方法培养人肝癌细胞系Huh-7和乳腺癌细胞系T 47D,用M TT法检测药物对肿瘤细胞生长的抑制作用;分别用不同剂量、同一剂量不同时间的CDP和... 详细信息

目的探讨中药成分CDP对肿瘤细胞系的生长抑制作用及其对抑癌基因p 16启动子区CpG岛的去甲基化作用。方法培养人肝癌细胞系Huh-7和乳腺癌细胞系T 47D,用M TT法检测药物对肿瘤细胞生长的抑制作用;分别用不同剂量、同一剂量不同时间的CDP和5-azacytid ine(5-aza-C)作用细胞;同时提取细胞的DNA,用甲基化特异性PCR(m ethy lation-spec ific PCR,M SP)的方法观察肿瘤细胞系p 16基因启动子区CpG岛甲基化/去甲基化的状态。结果①Huh-7和T 47D细胞系皆为抑癌基因p 16启动子区CpG岛完全发生甲基化的肿瘤细胞系。②CDP和5-aza-C以时间、剂量依赖方式抑制Huh-7和T 47D增殖。③在25、50、75和100μm o l/L的CDP持续作用6 d后,Huh-7和T 47D p 16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍然存在;Huh-7在四个剂量CDP作用下,非甲基化特异性条带被扩增出,T 47D则在50、75和100μm o l/L CDP作用下,非甲基化特异性条带被扩增出。④在50μm o l/L CDP作用后,Huh-7和T 47D p 16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍然存在;Huh-7非甲基化特异性条带自12 h出现并持续到144 h,而T 47D非甲基化特异性条带72 h出现并持续到144 h。结论中药成分CDP可以抑制肿瘤细胞的生长并可以逆转高甲基化的p 16基因,具有开发并成为抗肿瘤药物的潜在价值。

关键词：中药成分 CDP p16 去甲基化 Huh-7 T47D

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DNA损伤修复基因XRCC4、RAD51单核苷酸多态性与中国地区食管癌易感相关性研究

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四川大学学报（医学版） 2013年第4期44卷 568-572页

作者：范雪娇任朋亮卢钟娇赵书杨晓龙刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的探究DNA双链断裂修复基因XRCC4、RAD51单核苷酸多态性与食管癌易感性的关系。方法采用以医院为基础的病例-对照研究方法,应用PCR限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)检测包括正常对照61例,食管癌患者123例XRCC4基因启动子区G-1394... 详细信息

目的探究DNA双链断裂修复基因XRCC4、RAD51单核苷酸多态性与食管癌易感性的关系。方法采用以医院为基础的病例-对照研究方法,应用PCR限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)检测包括正常对照61例,食管癌患者123例XRCC4基因启动子区G-1394T(rs6869366)位点,以及RAD51-G135C位点的单核苷酸多态性。通过logistic回归分析计算出比值比(OR)和95%置信区间(95%CI)。结果 XRCC4rs6869366位点G等位基因的基因型(GT+GG)的携带者患食管癌的风险显著增加(OR=3.022,95%CI=1.487～6.142,P=0.002)。RAD51基因型GC和CC与携带GG的野生型个体相比,携带RAD51变异基因型(GC和CC)的个体具有更高的患癌风险(OR=3.643,95%CI=1.501～8.842,P<0.05)。结论 DNA损伤修复系统中的基因多态性很可能与食管癌发生的易感性有关,XRCC4G-1394T,RAD51-G135C位点多态性改变均可增加食管癌的发病风险。

关键词： XRCC4 RAD51 食管癌单核苷酸多态性

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人vigilin基因全长编码区的分段克隆及鉴定

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四川大学学报（医学版） 2008年第6期39卷 877-881页

作者：杨文理武静谢晓砚魏玲覃扬四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的为了探讨全长VIGILIN、VIGILIN的N端、VIGILIN的C端以及不同KH组合的功能,采取5分段扩增的策略克隆全长vigilin基因。方法根据vigilin基因全长编码区内的限制性核酸内切酶位点,将vigilin基因全长编码区分为5段。从意外死亡健康成人... 详细信息

目的为了探讨全长VIGILIN、VIGILIN的N端、VIGILIN的C端以及不同KH组合的功能,采取5分段扩增的策略克隆全长vigilin基因。方法根据vigilin基因全长编码区内的限制性核酸内切酶位点,将vigilin基因全长编码区分为5段。从意外死亡健康成人肝组织中提取总RNA,RT-PCR分段扩增目的基因,克隆至pUC118载体,测序,并亚克隆至pUC118载体,对接头部位测序。结果获得8个大小不同的人vigilin基因编码区片段和全长编码区。重组全长vigilin质粒pC118/vigilin(12+345)经测序,与GenBank上登陆的人vigilin cDNA(NM:005336)序列完全一致。结论用分段克隆的方法成功获得了人vigilin基因的全长编码区。

关键词： vigilin基因分段扩增克隆

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