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粘着斑激酶在TNF-α和环己亚胺协同诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡中的作用

Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2001年第1期33卷 53-58页

作者：方祎靳嘉巍查锡良卫生部糖复合物重点实验室!复旦大学医学院(原上海医科大学)生物化学教研室上海200032

探讨了粘着斑激酶 (focaladhesionkinase ,FAK)在TNF α和环己亚胺协同诱导SMMC 772 1细胞凋亡中的作用。利用转染FAK反义质粒来特异性降低SMMC 772 1细胞的FAK含量 ,用Western杂交的方法来检测蛋白激酶B(PKB)的蛋白含量 ,以及用流式细... 详细信息

探讨了粘着斑激酶 (focaladhesionkinase ,FAK)在TNF α和环己亚胺协同诱导SMMC 772 1细胞凋亡中的作用。利用转染FAK反义质粒来特异性降低SMMC 772 1细胞的FAK含量 ,用Western杂交的方法来检测蛋白激酶B(PKB)的蛋白含量 ,以及用流式细胞仪的方法来检测细胞的凋亡。研究发现TNF α本身并不能诱导SMMC 772 1细胞发生凋亡 ,而只有当用环己亚胺和TNF α协同处理时才发生凋亡。在TNF α和环己亚胺协同诱导的凋亡过程中 ,PKB蛋白含量随着TNF α剂量的增加、凋亡率的增加而降低 ,而单独用TNF α或环己亚胺处理均不能引起凋亡的增加及PKB含量的降低 ,提示PKB的蛋白水平与凋亡的发生密切相关。当用FAK反义质粒降低SMMC 772 1细胞的FAK含量 (约降低了 6 0 % )后 ,细胞对TNF α和环己亚胺协同诱导的凋亡的敏感性在用低剂量TNF α处理的情况下增加 ,而在高剂量TNF α处理的情况下降低。相应地 ,在低剂量TNF α和环己亚胺处理的情况下 ,FAK反义质粒转染株细胞的PKB含量比对照的PKB含量低 ;而在高剂量TNF α和环己亚胺处理的情况下 ,FAK反义质粒转染株细胞的PKB含量比对照的要高。结果提示 ,FAK对TNF α和环己亚胺协同诱导SMMC 772 1凋亡的过程有一双相作用 ,并且该过程可能与PKB有关

关键词：粘着斑激酶蛋白激酶B 凋亡肿瘤坏死因子α SMMC-7721细胞

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调节食欲生殖的信号肽在雄激素致不孕大鼠中的表达及滋肾阴药的作用

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上海医科大学学报 2000年第5期27卷 343-345页

作者：孙斐俞瑾武淑芳张利能查锡良上海医科大学妇产科医院中西医结合科中国科学院药物研究所国家新药研究重点实验室卫生部糖复合物重点实验室-上海医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室

目的　探讨雄激素不孕大鼠 (ASR)肥胖及无排卵的中枢机制及滋肾阴药的作用。方法　给出生 9日龄SD雌性大鼠一次性皮下注射丙酸睾丸酮 ,建立ASR模型。用原位杂交、双标原位杂交的方法检测与肥胖发生有关的几种信号肽 /激素如神经肽Y(NPY... 详细信息

目的　探讨雄激素不孕大鼠 (ASR)肥胖及无排卵的中枢机制及滋肾阴药的作用。方法　给出生 9日龄SD雌性大鼠一次性皮下注射丙酸睾丸酮 ,建立ASR模型。用原位杂交、双标原位杂交的方法检测与肥胖发生有关的几种信号肽 /激素如神经肽Y(NPY)、瘦素 (leptin)受体长体 (OB Rb)、前阿黑皮素原 (POMC)mRNA在ASR下丘脑弓状核 (ARC)的表达含量和其关系 ,以及灌服滋肾阴药后上述指标的变化。结果　ASR呈肥胖、无排卵状态。ASR的ARC中NPYmRNA神经元上有OB RbmRNA表达 ,NPYmRNA神经元与POMCmRNA神经元有突触联系。NPY和POMC基因表达水平明显增加 (P <0 .0 1) ,OB Rb 基因表达水平明显降低 (P <0 .0 1)。中药治疗ASR后 ,大鼠出现减肥和排卵现象 ,ARC中NPY、POMC基因表达下降 ,OB Rb 基因表达上升至正常大鼠水平 (P >0 .0 5 )。结论　ASR肥胖及无排卵可能与NPY、POMC基因过表达、OB Rb mRNA数目减少有关。

关键词：原位杂交方法不育症 ASR 中医药治疗信号肽

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α-1,6-岩藻糖转移酶活力在7721人肝癌细胞及HL-60白血病细胞诱导分化中的变化

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上海医科大学学报 1999年第2期26卷 122-124页

作者：刘飞刘爱华巨同忠陈惠黎卫生部糖复合物重点实验室-上海医科大学基础医学院生物化学教研室

目的研究肝癌细胞和白血病细胞诱导分化时α１，６岩藻糖转移酶（α１，６ＦｕｃＴ）的改变。方法采用生物素标记受体糖链，用ＬＣＡ亲和层析柱分离被核心岩藻糖化的产物，并以辣根过氧化酶（ＨＲＰ）标记的亲和素与柱上的产物结... 详细信息

目的研究肝癌细胞和白血病细胞诱导分化时α１，６岩藻糖转移酶（α１，６ＦｕｃＴ）的改变。方法采用生物素标记受体糖链，用ＬＣＡ亲和层析柱分离被核心岩藻糖化的产物，并以辣根过氧化酶（ＨＲＰ）标记的亲和素与柱上的产物结合，最后测定洗脱液中ＨＲＰ的活力，可代表α１，６ＦｕｃＴ活力。结果全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）或双丁酰环磷腺苷（ｄｂ－ｃＡＭＰ）诱导７７２１人肝癌细胞分化后，α１，６－ＦｕｃＴ活力均降低。ＡＴＲＡ或正丁酸使ＨＬ－６０早幼粒白细胞分化成粒细胞，佛波醇－１２－豆蔻酸－１３乙酸酯（ＰＭＡ）使ＨＬ－６０细胞分化成单核细胞时都使α１，６ＦｕｃＴ活力下降，而用二甲亚砜（ＤＭＳＯ）或神经节苷酯ＧＭ３使ＨＬ－６０细胞分化成粒细胞或单核细胞时，α１，６ＦｕｃＴ活力则上升。结论α１，６－ＦｕｃＴ活力下降是肝癌细胞的分化指标，但和ＨＬ－６０细胞的分化关系不大。

关键词： α-1,6-FucT 肝癌细胞 HL-60 白血病细胞诱导

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过表达整合蛋白α5β1的SMMC7721细胞株的建立和鉴定

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上海医科大学学报 1999年第3期26卷 161-164页

作者：周国飞范勤冯晔葛昊平查锡良卫生部糖复合物重点实验室上海医科大学基础医学院生物化学教研室

构建过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株。方法应用分子克隆技术和基因转染建立过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株，应用ＲＴ－ＰＣＲ及流式细胞术鉴定ＳＭＭＣ７７２１细胞表面整合蛋白α５β１的表达。结... 详细信息

构建过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株。方法应用分子克隆技术和基因转染建立过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株，应用ＲＴ－ＰＣＲ及流式细胞术鉴定ＳＭＭＣ７７２１细胞表面整合蛋白α５β１的表达。结果获得过表达整合蛋白α５／β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株α５．３－７７２１，β１．６－７７２１，α５β１．６－７７２１细胞。结论整合蛋白α５β１基因转染后，ＳＭＭＣ７７２１细胞整合蛋白α５β１的ＲＮＡ及蛋白质表达明显提高。

关键词：整合蛋白基因转染 SMMC7721细胞肝肿瘤

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β1-4半乳糖基转移酶检测方法的建立及动力学研究

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1997年第1期29卷 1-7页

作者：江松敏李溪冰王俏红顾建新上海医科大学卫生部糖复合物重点实验室上海医科大学卫生部糖复合物重点实验室上海医科大学基础医学院生物化学教研室 200032

本文分离纯化了人IgG的糖肽,去掉末端唾液酸和半乳糖,经肼解和荧光标记,用HPLC纯化了荧光标记的底物[Gnβ1-2Mα1-6（Gnβ1-2Mα1-3）Mβ1-4Gnβ1-4Gn-PA]。用正常雄性大鼠的肝细胞的微粒体作为酶源,建立了β1-4半乳糖基转移酶（β1-4G... 详细信息

本文分离纯化了人IgG的糖肽,去掉末端唾液酸和半乳糖,经肼解和荧光标记,用HPLC纯化了荧光标记的底物[Gnβ1-2Mα1-6（Gnβ1-2Mα1-3）Mβ1-4Gnβ1-4Gn-PA]。用正常雄性大鼠的肝细胞的微粒体作为酶源,建立了β1-4半乳糖基转移酶（β1-4GT）的荧光标记底物的HPLC测定方法,并确定了它的最适pH为6.5,最佳Triton X-100浓度为0.5%。然后用正常雄性大鼠的肝细胞的高尔基体作为酶源,测定了底物的Km和Vmax值,Km=2.31×10-3（mol/L）-1,Vmax=5.75×10-2μmol/（min·mg）。并发现了β1—4GT和α1—3甘露糖天线的N-乙酰氨基葡萄糖基比α1—6天线的反应性强2.10倍左右。

关键词： HPLC β1-4半乳糖基转移酶 K_m Vmax 天线特异性

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佛波酯促进CRBH7919细胞中磷脂酰胆碱水解及其酶学基础

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1997年第6期29卷 29-35页

作者：朱全胜查锡良上海医科大学基础医学院生物化学教研室卫生部糖复合物重点实验室

用佛波酯（佛波醇－１２－豆蔻酸－１３－乙酸酯，ＰＭＡ）作用大鼠肝癌ＣＲＢＨ７９１９细胞，发现ＰＭＡ能促进ＣＲＢＨ７９１９细胞中磷脂酰胆碱（ＰＣ）水解，此效应出现在ＰＭＡ作用细胞１５分钟后，且具有ＰＭＡ浓度依赖性。分析... 详细信息

用佛波酯（佛波醇－１２－豆蔻酸－１３－乙酸酯，ＰＭＡ）作用大鼠肝癌ＣＲＢＨ７９１９细胞，发现ＰＭＡ能促进ＣＲＢＨ７９１９细胞中磷脂酰胆碱（ＰＣ）水解，此效应出现在ＰＭＡ作用细胞１５分钟后，且具有ＰＭＡ浓度依赖性。分析ＰＣ水解产物，发现ＰＣ主要水解生成胆碱而不是磷酸胆碱。进一步测定膜结合磷脂酰胆碱专一性的磷脂酶Ｄ（ＰＣ－ＰＬＤ）活性，结果显示１００ｎｍｏｌ／ＬＰＭＡ作用细胞１０分钟即激活ＰＣ－ＰＬＤ，至３０分钟ＰＣ－ＰＬＤ活力增加至３．２５倍。ＰＭＡ激活ＰＣ－ＰＬＤ在时间上先于ＰＣ水解，提示在ＣＲＢＨ７９１９细胞中ＰＭＡ通过ＰＣ－ＰＬＤ水解ＰＣ产生磷脂酸和胆碱。

关键词：佛波酯磷脂酰胆碱磷脂酶D

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用酶联比色法测定肝脏磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D及其应用

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上海医科大学学报 1997年第5期24卷 342-346页

作者：黄勇吴兴中 QureshiImranAhmad 陈惠黎上海医科大学基础医学院生物化学教研室卫生部糖复合物重点实验室 200032

研究建立一种磷脂酞胆碱专一性磷脂酶D（PC—PLD）的酶偶联比色测定法，并研究肝脏中磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D（PC—PLD）活力受磷脂的调节及其在肝癌中的变化。将PLD水解磷脂酰胆碱产生的胆碱用胆碱氧化酶氧化，生成的H2O2再在过氧化... 详细信息

研究建立一种磷脂酞胆碱专一性磷脂酶D（PC—PLD）的酶偶联比色测定法，并研究肝脏中磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D（PC—PLD）活力受磷脂的调节及其在肝癌中的变化。将PLD水解磷脂酰胆碱产生的胆碱用胆碱氧化酶氧化，生成的H2O2再在过氧化物酶催化下将4-氨基安替匹林和酚氧化成粉红色有色物质（Trinder反应）。结果：本法中酶浓度或反应时间和产物胆碱量有良好的正比关系。用0.15％的正辛基β-吡喃葡萄糖苷可将PC-PLD从膜性组分中增溶出来，而基本上不抑制酶活力，而其他5种去垢剂即使在很低的浓度下，均能抑制该酶活力。应用此法测定6种磷脂对鼠肝PC—PLD的影响发现只有磷脂酰乙醇胺（PE）可激活PC—PLD，还发现鼠肝癌中膜结合性PC-PLD活力明显增高，尤其是癌前期；而胞液PC-PLD仅在癌前期增高。结论：结果表明，①PC-PLD的酶联比色测定法较简便，灵敏度和重复性也较好，可以满意地应用于组织和细胞中此酶活力变化的研究；②大鼠肝PC—PLD受PE激活，并在肝癌中升高。

关键词：肝脏磷脂酶D 酶偶联比色法细胞膜

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β1—4半乳糖基转移酶受体底物的动力学

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上海医科大学学报 1997年第5期24卷 339-342页

作者：吴国强江松敏顾建新上海医科大学基础医学院生物化学教研室卫生部糖复合物重点实验室 200032

研究β1-4半乳糖基转移酶（β1-4GT）与受体底物的亲和性、其底物的天线偏爱性以及糖基对亲和性的影响，以及β1-4GT对不同底物的天线特异性（branchspecificity）。用两种荧光标记的底物1（Gnβ1－2Mal－6（Gnβ1—2Mal－3）Mβ1－4Gn... 详细信息

研究β1-4半乳糖基转移酶（β1-4GT）与受体底物的亲和性、其底物的天线偏爱性以及糖基对亲和性的影响，以及β1-4GT对不同底物的天线特异性（branchspecificity）。用两种荧光标记的底物1（Gnβ1－2Mal－6（Gnβ1—2Mal－3）Mβ1－4Gnβ1—4Gn－PA）和底物2（Gnβ1－2Mal—6（Gnβ1－2Mal－3）Mβ1—4Gnβ1－4（Fucal－6）Gn－PA），用正常雄性大鼠的肝组织的高尔基体作为酶，测定β1－4GT的不同底物的Km值[1]。结果：底物1和2的Km值分别为2．31×10－3mol／L和3.12×10－3mol／L；对底物1，α1，3天线的N-乙酰氨基葡萄糖基比α1，6天线的反应性强，形成Gnβ1－2Mal－6（Gβ1－4Gnβ1－2Mal—3）Mβ1—4Gnβ1－4Gn—PA产物是Gβ1－4Goβ1—2MQl一6（Goβ1－2Mal－3）Mβ1－4Gnβ1－4Gn－PA的2．10倍左右；对底物2，α1，3天线的N-乙酰氨基葡萄糖基比α1，6天线的反应性更强，形成Gnβ1－2Mal－6（Gβ1－4Gnβ1－2Mal－3）Mβ1－4Gnβ1－4（Fucα1－6）Gn－PA的产物是Gβ1－4Gnβ1－2Mal－6（Gnβ1－2Mal－3）Mβ1－4Gnβ1－4（Fucα1—6）Gn－PA的4.59倍左右。结论：核心岩藻糖对酶与受体底物的亲和性有一定影响。

关键词：天线特异性高效液相色谱法糖蛋白 β1-4GT

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纤连蛋白受体分子中N-糖链对其与纤连蛋白结合的影响

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上海医科大学学报 1997年第5期24卷 331-334页

作者：曹立环查锡良上海医科大学基础医学院生物化学教研室 200032 卫生部糖复合物重点实验室 200032

研究纤连蛋白受体（FnR）分子中N-糖链对其与纤连蛋白（Fn）结合的影响。利用纤连蛋白片断亲和层析柱和麦胚凝集素亲和层析柱，从人胎盘组织中纯化得到了FnR，经SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳证实为α和β两个亚基所组成。制备嵌合FnR的脂质... 详细信息

研究纤连蛋白受体（FnR）分子中N-糖链对其与纤连蛋白（Fn）结合的影响。利用纤连蛋白片断亲和层析柱和麦胚凝集素亲和层析柱，从人胎盘组织中纯化得到了FnR，经SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳证实为α和β两个亚基所组成。制备嵌合FnR的脂质体后，用糖甘酶处理以获得合不同糖链结构FnR脂质体，研究FnR分子中糖链在受体与配体结合中的作用。结果：用唾液酸酶处理嵌合FnR的脂质体，与Fn的粘附能力保持不变。嵌合FnR的脂质体单用p-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶处理，或用唾液酶，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，β-半乳糖苷酶三者联合处理，其与Fn的粘附能力均下降50％。结论：FnR上糖链改变确实能影响FnR与Fn的结合，但FnR糖链上末端的唾液酸可能不影响两者的结合，而FnR糖链上末端或平分型N-乙酸氨基葡萄糖（GlcNAc）在两者结合时可能起重要作用。

关键词：纤连蛋白受体 N-糖链纤连蛋白 FnR

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诱导的HL60细胞表面β1-4半乳糖基转移酶的研究

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 1997年第4期29卷 78-84页

作者：吴国强江松敏顾建新上海医科大学卫生部糖复合物重点实验室上海医科大学基础医学院生物化学教研室上海医科大学基因研究中心

本文用荧光标记的受体底物〔Ｇｎβ１－２Ｍα１－６（Ｇｎβ１－２Ｍα１－３）Ｍβ１－４Ｇｎβ１－４（Ｆｕｃα１－６）Ｇｎ－ＰＡ〕，结合高效液相层析（ＨＰＬＣ）建立了细胞表面β１－４半乳糖基转移酶的活性检测方法。用这种方... 详细信息

本文用荧光标记的受体底物〔Ｇｎβ１－２Ｍα１－６（Ｇｎβ１－２Ｍα１－３）Ｍβ１－４Ｇｎβ１－４（Ｆｕｃα１－６）Ｇｎ－ＰＡ〕，结合高效液相层析（ＨＰＬＣ）建立了细胞表面β１－４半乳糖基转移酶的活性检测方法。用这种方法研究ＨＬ６０细胞，发现不同的培养时间，其细胞表面的酶变化明显，在２４小时酶活性最高，此时细胞处在分裂间期。用佛波酯（ＰＭＡ），视黄酸（ＲＡ）等细胞诱导分化剂处理ＨＬ６０细胞株时，发现其表面活性发生了明显的变化，ＰＭＡ诱导的细胞其表面酶活性在２４小时变化最大，升高到对照的１．３倍；而ＲＡ处理的细胞其表面酶活性在７２小时变化最大，升高到对照的１．７２倍。

关键词： HPLC β1-4半乳糖基转移酶 PMA RA

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