检索结果-内蒙古大学图书馆

T细胞活化接头蛋白棕榈酰化位点突变抑制CD59 GPI介导的T淋巴细胞活化信号转导

细胞与分子免疫学杂志 2015年第8期31卷 1013-1016,1021页

作者：高美华王丽娜王冰丛蓓蓓张树超青岛大学医学院免疫学教研室山东青岛266071

目的构建T细胞活化接头蛋白(LAT)棕榈酰化位点突变的慢病毒,感染Jurkat细胞,建立稳定转染的细胞株,观察LAT棕榈酰化位点突变对CD59介导的T淋巴细胞活化信号转导的影响。方法构建阴性对照(neg-EGFP)、LAT-M-EGFP融合蛋白基因载体,包装成... 详细信息

目的构建T细胞活化接头蛋白(LAT)棕榈酰化位点突变的慢病毒,感染Jurkat细胞,建立稳定转染的细胞株,观察LAT棕榈酰化位点突变对CD59介导的T淋巴细胞活化信号转导的影响。方法构建阴性对照(neg-EGFP)、LAT-M-EGFP融合蛋白基因载体,包装成慢病毒,分别感染Jurkat细胞,建立稳定感染的细胞株。激光共聚焦显微镜观察病毒感染效率及融合蛋白在细胞上的定位;CCK-8法检测CD59单克隆抗体交联前后各组细胞的增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot法检测磷脂酶Cγ1(PLC-γ1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)蛋白的表达。结果共聚焦显微镜观察发现LAT-M组细胞的LAT分子在细胞膜上散在分布,CD59抗体交联刺激后,未出现明显的点簇状聚集区。与阴性对照细胞相比,LAT-M细胞增殖活性明显降低,中晚期凋亡细胞明显增加;Western blot结果显示,LAT-M组的PLC-γ1、LCK蛋白表达水平和阴性对照组大致相同,经抗体活化后无明显变化,而阴性对照细胞的PLC-γ1、LCK蛋白表达量下降。结论 LAT棕榈酰化位点突变的Jurkat细胞脂筏定位功能缺失,细胞处于抑制状态,对CD59糖基磷脂酰肌醇(GPI)介导的T淋巴细胞活化信号转导有抑制作用。

关键词： CD59 棕榈酰化信号转导

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突变人CD59分子抗MAC沉积在糖尿病血管病中的作用

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第9期25卷 774-776,779页

作者：张丽高美华青岛大学医学院免疫学教研室山东青岛266000

目的:研究糖化人突变(HM)CD59作为补体攻膜复合体(MAC)抑制物在糖尿病血管病病理机制中的重要作用。方法:构建2种HMCD59重组质粒,转染CHO细胞;FCM、Western blot筛选高表达细胞。糖化,BCECF释放试验测定糖化HMCD59和糖化HNCD59抗补体活... 详细信息

目的:研究糖化人突变(HM)CD59作为补体攻膜复合体(MAC)抑制物在糖尿病血管病病理机制中的重要作用。方法:构建2种HMCD59重组质粒,转染CHO细胞;FCM、Western blot筛选高表达细胞。糖化,BCECF释放试验测定糖化HMCD59和糖化HNCD59抗补体活性。ELISA测定30例糖尿病无血管病变组和30例Ⅱ型糖尿病血管病组血清PDGF-BB、VEGF含量。结果:筛选细胞株表达率分别为59.8%、53.7%、54.5%;BCECF释放试验显示糖化前转染突变CD59细胞比较糖化后细胞染料释放率低(P<0.01);而正常CD59细胞比较糖化后细胞染料释放率无统计学意义。Ⅱ型糖尿病有血管病变组与糖尿病无血管病变组相比,血清PDGF-BB、VEGF明显增高(P<0.01)。结论:证实HMCD59易糖化抗补体活性下降加速糖尿病血管病的发生发展。

关键词： CD59 真核表达糖化补体免疫分子

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前列腺细胞高表达的CD59分子活性位点的封闭研究

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免疫学杂志 2009年第1期25卷 68-70,74页

作者：解西河高美华青岛大学医学院免疫学教研室

目的观察噬菌体肽库筛选的短肽(SP22)对前列腺癌细胞高表达的正常或突变CD59分子活性位点的封闭效果。方法将正常和突变CD59基因、pIRES空质粒分别转染PC-3细胞;流式细胞术检测细胞表面CD59分子的表达;RT-PCR检测CD59基因的mRNA表达;补... 详细信息

目的观察噬菌体肽库筛选的短肽(SP22)对前列腺癌细胞高表达的正常或突变CD59分子活性位点的封闭效果。方法将正常和突变CD59基因、pIRES空质粒分别转染PC-3细胞;流式细胞术检测细胞表面CD59分子的表达;RT-PCR检测CD59基因的mRNA表达;补体溶解试验观察SP22对补体介导的PC-3细胞溶解的影响。结果CD59基因成功转染并表达;wPC-3细胞(转染正常CD59基因)和mPC-3细胞(转染突变CD59基因)内CD59 mRNA表达水平显著高于pPC-3细胞(转染空质粒)(P<0.01);SP22使3种细胞的溶解率明显提高(P<0.01),但升高的模式和幅度显著不同。结论SP22不能封闭突变CD59分子的补体结合位点,但可与PC-3细胞表面的正常CD59分子高效结合并中和其补体抑制活性,进而显著增强补体对PC-3细胞的溶解。

关键词：补体 CD59 短肽前列腺癌 RT-PCR

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人CD59基因的突变和表达及其活性研究

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第2期21卷 151-154页

作者：张艳丽高美华青岛大学医学院免疫学教研室山东青岛266021

　目的: 构建人突变CD59(hmCD59)基因的真核表达系统, 深入研究hmCD59在糖尿病血管并发症中的作用。方法: 分别构建两种含有hmCD59全长cDNA序列的重组pALTER质粒, 运用脂质体介导法, 与pcDNA3质粒共转染CHO细胞, 以G418筛选阳性克隆(编... 详细信息

　目的: 构建人突变CD59(hmCD59)基因的真核表达系统, 深入研究hmCD59在糖尿病血管并发症中的作用。方法: 分别构建两种含有hmCD59全长cDNA序列的重组pALTER质粒, 运用脂质体介导法, 与pcDNA3质粒共转染CHO细胞, 以G418筛选阳性克隆(编号为hmCD59- 1- CHO及hmCD59 -2- CHO)。应用荧光抗体技术、免疫酶联技术及Westernblot, 进一步检测hmCD59蛋白在转染细胞膜表面的表达。通过双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯 (BCECF/AM)荧光染料释放试验, 对hmCD59蛋白糖基化前后的抗补体活性进行检测。结果: 筛选出的阳性克隆细胞用荧光抗体技术免疫酶联技术检测表明, 在细胞膜表面有hmCD59分子表达。将细胞的裂解物进行Westernblot证实, 在其相对分子质量(Mr)为 20 000处可见 1条与CD59的Mr相当的蛋白带。BCECF/AM荧光染料释放试验提示, 两种突变质粒的表达产物均具有抗补体活性, 糖基化后活性减弱。结论: 获得两株可稳定表达hmCD59的细胞。表达的hmCD59具有抗补体活性, 但糖基化后活性减弱。

关键词：人突变CD59 真核表达中国仓鼠卵巢细胞抗补体活性

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利用噬菌体肽库筛选与人CD59特异性结合的短肽

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细胞与分子免疫学杂志 2006年第2期22卷 164-166页

作者：程颖高美华青岛大学医学院免疫学教研室山东青岛266021

目的:筛选并鉴定与人CD59分子特异结合的短肽,为设计具有拮抗CD59肿瘤逃逸活性的短肽封条奠定基础。方法:以高表达人CD59的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为靶细胞,采用竞争结合试验,对噬菌体随机12肽库进行5轮亲和筛选。用ELISA筛选噬菌体阳性... 详细信息

目的:筛选并鉴定与人CD59分子特异结合的短肽,为设计具有拮抗CD59肿瘤逃逸活性的短肽封条奠定基础。方法:以高表达人CD59的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为靶细胞,采用竞争结合试验,对噬菌体随机12肽库进行5轮亲和筛选。用ELISA筛选噬菌体阳性克隆并对其进行DNA序列分析。结果:随机挑选的16个克隆中,有8个与人CD59的结合力高。测序后,得到3个高度同源的氨基酸序列。DNAstar分析显示,3个序列均与已公布的(PubMed)人CD2的氨基酸序列有一定的同源性。结论:获得的序列H×A××××××P××为设计肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽封条提供了技术基础。

关键词：人CD59 肿瘤逃逸噬菌体肽库短肽封条

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人CD59突变促进糖尿病血管并发症发生

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免疫学杂志 2009年第6期25卷 693-696页

作者：张丽高美华青岛大学医学院免疫学教研室

目的证实人CD59突变抗补体活性下降,促进糖尿病血管并发症的发生发展。方法构建2种HMCD59重组质粒,转染CHO细胞;FCM筛选高表达细胞,荧光免疫测定和固相酶免疫测定加一步检测阳性细胞。糖化培养阳性细胞,BCECF染料释放试验比较糖化人突变... 详细信息

目的证实人CD59突变抗补体活性下降,促进糖尿病血管并发症的发生发展。方法构建2种HMCD59重组质粒,转染CHO细胞;FCM筛选高表达细胞,荧光免疫测定和固相酶免疫测定加一步检测阳性细胞。糖化培养阳性细胞,BCECF染料释放试验比较糖化人突变CD59和糖化人正常CD59抗补体活性。ELISA测定30例糖尿病无血管病变组和30例Ⅱ型糖尿病血管病组血清PDGF、bFGF含量。结果筛选细胞株表达率分别为59.8%、53.0%、54.5%;BCECF染料释放试验显示糖化后人突变CD59细胞比较糖化前染料释放率高(P<0.01);而正常CD59细胞较糖化后细胞染料释放率差异不明显(P>0.05)。Ⅱ型糖尿病有血管病变组与糖尿病无血管病变组相比,血清PDGF、bFGF明显增高(P<0.01)。结论证实人CD59突变后易糖化抗补体活性下降加速糖尿病血管病的发生发展。

关键词： CD59 真核表达糖化补体免疫分子

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重组可溶性MHCI类相关蛋白A对NK细胞生物学活性的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第10期25卷 903-906页

作者：龚卫娟王海洋范敏其龚春香刘丹季明春扬州大学医学院免疫学教研室江苏扬州225001

目的:研究体外重组可溶性MHCI类相关蛋白A(sMICA)对NK细胞杀伤靶细胞活性、分泌IFN-γ、增殖和凋亡的影响。方法:将重组sMICA蛋白与人外周血NK细胞相互作用过夜后,流式细胞仪检测NK细胞杀伤K562靶细胞的能力;ELISA检测培养上清IFN-γ浓... 详细信息

目的:研究体外重组可溶性MHCI类相关蛋白A(sMICA)对NK细胞杀伤靶细胞活性、分泌IFN-γ、增殖和凋亡的影响。方法:将重组sMICA蛋白与人外周血NK细胞相互作用过夜后,流式细胞仪检测NK细胞杀伤K562靶细胞的能力;ELISA检测培养上清IFN-γ浓度;MTS/PMS法检测sMICA对NK细胞增殖的影响;给NK细胞标记Annexin V和碘化丙啶检测凋亡情况。结果:可溶性MICA抑制NK细胞杀伤K562细胞的活性,下调IFN-γ的分泌,却对NK细胞的增殖和凋亡没有影响。结论:肿瘤细胞表面脱落的sMICA抗原可通过抑制NK细胞活性而逃逸机体的免疫监视功能。

关键词： MHCI类相关蛋白A NK细胞细胞毒活性增殖凋亡

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突变型CD59蛋白对卵巢癌细胞的抑瘤效应

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癌症 2009年第4期28卷 379-383页

作者：李健敏高美华张蓓青岛大学医学院免疫学教研室山东青岛266071

背景与目的:国外报道已在多种实体肿瘤细胞中发现有CD59分子的过表达,并与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关。本研究探讨突变型CD59在卵巢癌细胞A2780表面的抗补体活性以及与LPS联合抑制A2780细胞增殖的活性。方法:取突变型CD59质粒... 详细信息

背景与目的:国外报道已在多种实体肿瘤细胞中发现有CD59分子的过表达,并与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关。本研究探讨突变型CD59在卵巢癌细胞A2780表面的抗补体活性以及与LPS联合抑制A2780细胞增殖的活性。方法:取突变型CD59质粒、野生型CD59质粒分别转染A2780细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,并从基因水平和蛋白水平鉴定CD59突变基因和野生型基因的转染情况。MTT法观察野生型CD59与突变型CD59在A2780细胞表面的抗补体活性,以及突变型CD59在LPS存在时对细胞的抑瘤效应。结果:通过荧光免疫检测、流式细胞术分析、RT-PCR鉴定证明建立了稳定转染野生型和突变型CD59的A2780细胞。MTT结果显示,与野生型CD59相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能,与对照组未转染的A2780细胞相比无显著性差异。MTT检测5μg/mLLPS作用30min,对转染野生型CD59、突变型CD59及未转染A2780细胞的增殖抑制率分别为(26.9±2.95)%、(36.3±4.87)%、(29.6±3.16)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭该位点能够提高补体溶细胞作用,并有助于LPS发挥抑制瘤细胞增殖活性,有望应用于肿瘤治疗。

关键词： CD59 补体基因突变 A2780细胞卵巢肿瘤

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CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞凋亡作用的研究

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第1期24卷 20-22,26页

作者：李先平高美华青岛大学医学院免疫学教研室山东青岛266021

目的:研究CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞凋亡相关基因(survivin、caspase-3及bax)的表达作用,探讨CD59特异位点的短肽封条促HeLa细胞凋亡的作用机制。方法:将CD59特异位点的短肽封条分别作用于HeLa细胞和转CD59基因的HeLa细胞。作用... 详细信息

目的:研究CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞凋亡相关基因(survivin、caspase-3及bax)的表达作用,探讨CD59特异位点的短肽封条促HeLa细胞凋亡的作用机制。方法:将CD59特异位点的短肽封条分别作用于HeLa细胞和转CD59基因的HeLa细胞。作用24 h后,采用MTT的方法来检测细胞增殖抑制率;并利用免疫组织化学方法检测sur-vivin,caspase-3及其bax的表达水平。结果:转CD59基因的HeLa细胞+短肽的细胞组增殖抑制率大于HeLa细胞+短肽组(P<0.01)。转CD59基因的HeLa细胞+短肽组和正常的HeLa细胞+短肽组相比较,survivin表达水平降低(P<0.05);而caspase-3表达水平增高(P<0.05);bax的表达量各组比较,差别无统计学意义。结论:CD59特异位点的短肽封条具有下调survivin的表达,活化caspase-3,从而促进HeLa细胞的凋亡。

关键词： CD59 短肽封条 HeLa细胞细胞凋亡 survivin caspase-3 bax

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CD59活性位点相关性基因突变的构建与表达

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高技术通讯 2008年第6期18卷 645-649页

作者：朱新红高美华任书荣王秋波林存智青岛大学医学院免疫学教研室青岛266071 青岛市胸科医院免疫研究室青岛266043

构建了野生型和突变型 CD59重组质粒,建立了高效真核表达系统,探讨了 W40位点的生物学活性。采用基因点突变技术使 CD59 W40基因位置缺失(突变1,M1)及C39W40K41→W39W40W41(突变2,M2),重叠延伸 PCR(overlap extension PCR)定点诱变扩增... 详细信息

构建了野生型和突变型 CD59重组质粒,建立了高效真核表达系统,探讨了 W40位点的生物学活性。采用基因点突变技术使 CD59 W40基因位置缺失(突变1,M1)及C39W40K41→W39W40W41(突变2,M2),重叠延伸 PCR(overlap extension PCR)定点诱变扩增突变基因,重组入真核表达质粒 pIRES,利用阳离子脂质体(Lipfectamine2000)将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行表达。酶切鉴定及序列测定证实成功构建了 pIRES-M1CD59、pIRES-M2CD59和 pIRES-WTCD59,突变基因约500bp。G418筛选出了 CHO 转染细胞的稳定细胞克隆,免疫荧光、ELISA 检测筛选 M1CD59、M2CD59和 WTCD59蛋白高表达株,连续传代30代有高表达;补体溶细胞反应显示与野生型 CD59相比,突变型 M1CD59失去对补体的抑制功能,而 M2CD59抗补体活性略增高。证实 CD59的 W40位点对其功能具有重要作用,封闭此位点可提高补体活性,有望用于肿瘤治疗。

关键词： CD59 基因突变真核表达重叠延伸PCR 补体

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