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中国兽医病理学2017年学术研讨会暨兽医病理学分会第九届全国会员代表大会

作者：徐鹏赵权王泽东刘全周铁忠吉林农业大学动物科技学院长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所长春 130062 锦州医科大学畜牧兽医学院锦州 121001

弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，它可以感染包括人类在内的几乎所有哺乳动物。本试验采用不同剂量△TgMAPK1、TgComplement 和TgGT1 的速殖子接种小鼠，统计分析小鼠的平均存活时间及存活小鼠肝、脑组织内的虫体数量，确定弓形虫MAPK1... 详细信息

弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，它可以感染包括人类在内的几乎所有哺乳动物。本试验采用不同剂量△TgMAPK1、TgComplement 和TgGT1 的速殖子接种小鼠，统计分析小鼠的平均存活时间及存活小鼠肝、脑组织内的虫体数量，确定弓形虫MAPK1 对体内致病性及增值的影响。采用BDTMCBA 技术通过流式细胞仪检测比较△TgMAPK1 与TgGT1 在接种小鼠后第3 天和第7 天时血清和腹腔液内细胞因子的表达差异，推测MAPK1 基因对体内细胞因子变化的影响。结果表明：小鼠体内致病性试验表明MAPK1 缺失可降低弓形虫对小鼠的致病力，降低其在小鼠体内增殖速度，表明TgMAPK1 是弓形虫的一种新的毒力基因。腹腔液中细胞因子表达差异试验表明MAPK1 基因可能是通过调控IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和IL-10 的表达而促进腹腔内巨噬细胞活化，进而杀灭弓形虫。血清中细胞因子表达差异试验表明MAPK1 基因可能是通过调控IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-10 的表达而促使机体由Th2 型免疫应答向Th1 型的转变，从而建立潜伏感染或慢性感染。

关键词：弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1 TgMAPK1 基因敲除

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刚地弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因克隆、表达及抗原性分析

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中国兽医学报 2016年第2期36卷 265-270页

作者：徐鹏曹利利王泽东赵权辽宁医学院畜牧兽医学院辽宁锦州121001 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林省畜牧兽医研究院吉林长春130062 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118

克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)丝裂原活化蛋白激酶1(TgMAPK1)基因片段,并分析其抗原性。提取弓形虫GT1株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。RT-PCR扩增TgMAPK1基因。扩增产物经双酶切后连接入pET28a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希... 详细信息

克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)丝裂原活化蛋白激酶1(TgMAPK1)基因片段,并分析其抗原性。提取弓形虫GT1株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。RT-PCR扩增TgMAPK1基因。扩增产物经双酶切后连接入pET28a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(Escherichia Coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1转化至*** BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。RT-PCR扩增产物约为1 599bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约58 000的包涵体重组蛋白。Western blotting分析证实其能被鼠抗弓形虫血清识别。刚地弓形虫GT1株TgMAPK1基因片段可在原核表达系统中表达,且该重组蛋白具有抗原性。

关键词：刚地弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1 基因克隆原核表达抗原性

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弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析

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黑龙江畜牧兽医 2015年第9期 1-4,291页

作者：徐鹏曹利利李霞王泽东赵权刘全吉林农业大学动物科技学院长春130118 辽宁医学院畜牧兽医学院辽宁锦州121001 军事医学科学院军事兽医研究所长春130062 吉林省畜牧兽医研究院长春130062 锦州市畜牧兽医局辽宁锦州121000

为了分析并预测弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1（TgMAPK1）基因编码蛋白的结构与功能,探讨其作为疫苗候选抗原及潜在药物靶点的可能性,试验从Gen Bank数据库获取Tg MAPK1基因序列,采用在线蛋白分析专家系统（http：//***/）,结合DNAMAN、DNA... 详细信息

为了分析并预测弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1（TgMAPK1）基因编码蛋白的结构与功能,探讨其作为疫苗候选抗原及潜在药物靶点的可能性,试验从Gen Bank数据库获取Tg MAPK1基因序列,采用在线蛋白分析专家系统（http：//***/）,结合DNAMAN、DNAStar等生物信息学软件对该序列的编码区进行分析,预测该基因编码蛋白质的理化性质、翻译后修饰位点、功能域、亚细胞定位、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等。结果表明：该基因全长为1772 bp,编码区为133-1731 bp,编码532个氨基酸。编码蛋白性质稳定,理论分子质量为58.376 ku。TgMAPK1蛋白有5个跨膜区,有3个N端糖基化位点、7个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪氨酸激酶磷酸化位点、2个环腺苷酸蛋白激酶磷酸化位点、10个N端肉豆蔻酰化位点及1个酰胺化位点;无信号肽,二级结构以无规卷曲为主;Tg MAPK1基因主要存在于弓形虫虫体外膜上,有20个潜在的抗原表位。说明弓形虫TgMAPK1基因编码蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫病疫苗候选抗原。

关键词：刚地弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1) 生物信息学蛋白质结构抗原表位

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基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒可视化基因芯片与荧光基因芯片的建立

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中国生物化学与分子生物学报 2014年第10期30卷 1047-1054页

作者：薛斐田明尧辛舒任静强孙文超阎富龙温树波鲁会军田宇飞金宁一军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 吉林农业大学动物科技学院长春130118 吉林大学畜牧兽医学院长春130062

根据GenBank中收录的基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒E蛋白基因序列,设计及筛选针对2种病毒的寡核苷酸探针及引物,制备基孔肯雅病毒与辛德毕斯病毒可视化基因芯片与荧光基因芯片,对芯片的灵敏性、特异性进行了验证,并将可视化基因芯片、荧... 详细信息

根据GenBank中收录的基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒E蛋白基因序列,设计及筛选针对2种病毒的寡核苷酸探针及引物,制备基孔肯雅病毒与辛德毕斯病毒可视化基因芯片与荧光基因芯片,对芯片的灵敏性、特异性进行了验证,并将可视化基因芯片、荧光基因芯片进行灵敏性比较.结果显示,制备的两种基因芯片都能检测到基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒特异性杂交信号.可视化基因芯片、荧光基因芯片检测两种病毒质粒的灵敏度达到9.1×103copies/mL,6.8×101copies/mL和9.1×104copies/mL,6.8×103copies/mL,与普通PCR比较差异显著.荧光基因芯片灵敏度是PCR方法的10倍,可视化基因芯片是荧光基因芯片灵敏度的100倍.模拟病毒检测过程特异性检验证明,可视化基因芯片都具有良好的特异性.本试验建立了基孔肯雅病毒与辛德毕斯病毒两种特异的可视化和荧光基因芯片检测方法,两种方法灵敏度高、特异性强,适用于基孔肯雅病毒与辛德毕斯病毒的流行病学调查和种特异性鉴定.

关键词：基孔肯雅病毒辛德毕斯病毒基因芯片可视化

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乙型脑炎病毒可视化分型基因芯片的制备

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生物技术通讯 2014年第3期25卷 377-380,390页

作者：薛斐辛舒田宇飞孙文超温树波阎富龙盛媛王茂鹏朱羿龙田明尧金宁一军事医学科学院军事兽医研究所省部共建吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

目的:制备乙型脑炎病毒(JEV)可视化分型基因芯片。方法:根据JEV的基因组序列,应用生物学软件设计JEV分型引物及探针,制备其可视化分型基因芯片;用生物素标记的引物PCR扩增目的片段,并与固定于玻片上的探针杂交,加入链霉亲和素标记的纳米... 详细信息

目的:制备乙型脑炎病毒(JEV)可视化分型基因芯片。方法:根据JEV的基因组序列,应用生物学软件设计JEV分型引物及探针,制备其可视化分型基因芯片;用生物素标记的引物PCR扩增目的片段,并与固定于玻片上的探针杂交,加入链霉亲和素标记的纳米金,银增强实现可视化;进行特异性、灵敏性及重复性试验。结果:探针特异地与相应的标记目的基因片段杂交,并在芯片上呈现较强的阳性杂交信号;2号探针能特异性检出JEV,3、4号探针可分别对Ⅰ型和Ⅲ型JEV进行分型;芯片对JEV质粒检测的灵敏度达105拷贝/mL;以蓝耳病病毒等5种病毒为对照,芯片只对JEV响应,具有特异性;制备的基因芯片具有批间、批内重复性。结论:制备的基因芯片具有高特异性、灵敏性及重复性,可以快速、准确、高通量地对JEV进行可视化分型检测。

关键词：乙型脑炎病毒基因型基因芯片可视化

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新生长白仔猪尾尖成纤维细胞的分离培养及其对猪瘟病毒的易感性分析

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中国兽医学报 2013年第3期33卷 326-329页

作者：武蓉戴祯赵致阳高飞全龙泉逄大欣王铁东涂长春欧阳红生吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062

以出生2日龄的正常长白仔猪尾尖组织为材料,通过组织消化法培养获得原代尾尖成纤维细胞。并通过间接免疫荧光法,梯度10倍倍比稀释猪瘟病毒石门株(105.2 TCID50/mL)感染在猪尾尖成纤维细胞,确定尾尖成纤维细胞最佳病毒感染滴度。结果显示... 详细信息

以出生2日龄的正常长白仔猪尾尖组织为材料,通过组织消化法培养获得原代尾尖成纤维细胞。并通过间接免疫荧光法,梯度10倍倍比稀释猪瘟病毒石门株(105.2 TCID50/mL)感染在猪尾尖成纤维细胞,确定尾尖成纤维细胞最佳病毒感染滴度。结果显示,运用组织块消化法能够获得生长状态的原代猪尾尖成纤维细胞,并且细胞对10-3稀释倍数的猪瘟病毒石门株具有适中的感染力。

关键词：猪尾成纤维细胞分离细胞培养转基因动物病毒易感性猪

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狂犬病病毒CVS-11株全序列测定及其感染性克隆的构建

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微生物学报 2013年第4期53卷 409-415页

作者：薛向红郑学星盖微微梁红茹马金柱李岭王铁成冯娜黄耕赵永坤杨松涛夏咸柱吉林大学畜牧兽医学院长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122

【目的】测定狂犬病病毒标准攻击毒CVS-11株全基因组序列,构建CVS-11株全长cDNA感染性克隆。【方法】RT-PCR扩增CVS-11株全基因组得到有重叠的12个片段,分别克隆至平端载体pEASY-Blunt,测定CVS-11株全基因组核苷酸序列。用软件DNAMAN分... 详细信息

【目的】测定狂犬病病毒标准攻击毒CVS-11株全基因组序列,构建CVS-11株全长cDNA感染性克隆。【方法】RT-PCR扩增CVS-11株全基因组得到有重叠的12个片段,分别克隆至平端载体pEASY-Blunt,测定CVS-11株全基因组核苷酸序列。用软件DNAMAN分析CVS-11全序列单一性酶切位点,设计引物,分4段扩增CVS-11全基因组,扩增产物经多步酶切、连接逐步插入至真核表达载体pcDNA3.1,获得全长质粒pcDNA3.1-CVS-11。pcDNA3.1-CVS-11与其辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L、G共转染NA细胞,经免疫荧光染色、RT-PCR鉴定,拯救得到重组病毒rCVS-11。【结果】CVS-11全基因组序列由11 927个核苷酸组成,编码5个结构蛋白,结构基因排列同已知的其他狂犬病病毒一致。成功构建了CVS-11全长cDNA重组质粒pcDNA3.1-CVS-11和其辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L和G。经共转染,成功拯救了重组病毒rCVS-11。【结论】CVS-11株感染性克隆的构建为从分子水平上进一步研究狂犬病病毒奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒 CVS-11 全序列测定感染性cDNA克隆

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鸡沙门菌恩诺沙星耐药性风险评估

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中国兽医学报 2013年第2期33卷 254-258页

作者：李乾学王大成吴永魁夏志平邓旭明军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

采用世界动物卫生组织(OIE)通用的方法,建立动物模型,对鸡沙门菌恩诺沙星耐药性进行释放评估和暴露评估。通过释放评估证实,防突变浓度与最小抑菌浓度相比增高4～16倍,说明细菌极易发生突变产生耐药性,细菌在体外诱导容易产生耐药性。... 详细信息

采用世界动物卫生组织(OIE)通用的方法,建立动物模型,对鸡沙门菌恩诺沙星耐药性进行释放评估和暴露评估。通过释放评估证实,防突变浓度与最小抑菌浓度相比增高4～16倍,说明细菌极易发生突变产生耐药性,细菌在体外诱导容易产生耐药性。耐药基因可通过接合的方式进行转移。暴露评估中,感染耐药菌的小鼠与未感染小鼠接触,未经感染小鼠暴露于动物垫料及未处理的粪便中,未感染小鼠分离的沙门菌也出现耐药性,说明细菌耐药性可在动物之间、动物与环境之间转移。耐药菌易在小鼠结肠中定植。耐药菌存在扩散的风险。

关键词：沙门菌恩诺沙星耐药性风险评估

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新型狂犬病病毒中和抗体检测方法的建立

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中国生物制品学杂志 2013年第8期26卷 1165-1169,1174页

作者：薛向红郑学星盖微微李岭马金柱冯娜王铁成黄耕赵永坤杨松涛夏咸柱吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130062

目的建立一种安全、快速、经济的新型狂犬病病毒中和抗体的检测方法。方法在狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury基因组Ψ区插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein eGFP)基因,利用反向遗传技术,拯救重组病毒rHEP-eGFP,分别... 详细信息

目的建立一种安全、快速、经济的新型狂犬病病毒中和抗体的检测方法。方法在狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury基因组Ψ区插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein eGFP)基因,利用反向遗传技术,拯救重组病毒rHEP-eGFP,分别采用荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定及电镜观察等方法对rHEP-eGFP病毒进行鉴定;分别绘制rHEP-eGFP和亲本毒株HEP-Flury的生长动力学曲线;将rHEP-eGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,测定各代次rHEP-eGFP的滴度,荧光显微镜下观察eGFP的表达;采用TCID50法检测狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11和rHEP-eGFP的毒力;以rHEP-eGFP病毒为抗原,建立新型荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibodyvirus neutralization,FAVN)-eGFP,对25份犬血清的抗体效价进行测定,并与标准FAVN检测结果进行比较。结果经荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定和电镜观察表明,成功拯救出rHEP-eGFP病毒;重组病毒rHEP-eGFP与亲本病毒HEP-Flury的生长特性相似;rHEP-eGFP连续传代9次,均能稳定表达eGFP;CVS-11的毒力为108TCID50/ml,rHEP-eGFP的毒力为107.3TCID50/ml;FAVN-eGFP与FAVN测定25份犬血清抗体效价的结果具有良好的一致性。结论建立的新型狂犬病病毒中和抗体检测方法(FAVN-eGFP)准确度高,特异性好。

关键词：狂犬病病毒 HEP-Flury株绿色荧光蛋白荧光抗体病毒中和试验血清效价

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人树突状细胞分离与鉴定最新研究进展

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中国免疫学杂志 2013年第10期29卷 1093-1097页

作者：王茂鹏杜寿文李昌金宁一吉林大学畜牧兽医学院长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122

树突状细胞（dendriticcell，DC）是最重要的抗原提呈细胞．在许多疾病过程中发挥免疫调节作用。DC的发现者Steinman对它在获得性免疫中的作用进行了深入研究。Beutler深人探讨了DC在固有免疫中的作用．2011年他们以此获得诺贝尔生理或... 详细信息

树突状细胞（dendriticcell，DC）是最重要的抗原提呈细胞．在许多疾病过程中发挥免疫调节作用。DC的发现者Steinman对它在获得性免疫中的作用进行了深入研究。Beutler深人探讨了DC在固有免疫中的作用．2011年他们以此获得诺贝尔生理或医学奖，充分表明DC在免疫学领域的重大意义。

关键词：树突状细胞细胞分离诺贝尔生理或医学奖鉴定免疫调节作用抗原提呈细胞获得性免疫疾病过程

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