目的建立体外高表达细胞因子信号转导负调控蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的细胞模型,为进一步研究SOCS3在炎症因子信号通路中的作用机制提供研究手段。方法通过RT-PCR克隆SOCS3的编码片段,连接至pIRES2-EGFP真核表...
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目的建立体外高表达细胞因子信号转导负调控蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的细胞模型,为进一步研究SOCS3在炎症因子信号通路中的作用机制提供研究手段。方法通过RT-PCR克隆SOCS3的编码片段,连接至pIRES2-EGFP真核表达质粒,经测序鉴定后,转染至293T细胞。通过荧光显微镜观测转染效率,RT-PCR和Western印迹法检测SOCS3表达情况,同时检测SOCS3高表达对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的信号转导和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)磷酸化的影响。结果经测序证实,pIRES2-EGFP-SOCS3重建质粒中的SOCS3序列完全正确,转染后细胞中可见明显绿色荧光,且SOCS3在mRNA和蛋白水平表达均显著增加,过表达SOCS3可显著抑制由LPS诱导的STAT3的磷酸化。结论成功构建SOCS3基因重组质粒,转染293T细胞,获得高表达具有功能性SOCS3分子。该细胞模型建立为进一步研究SOCS3的调节机制提供了有利工具。
目的筛选K48聚泛素链在肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated facto r 2,T RA F2)上的主要修饰位点。方法比较不同物种间的T RA F2氨基酸序列,选出人T RA F2上保守率在90%以上的赖氨酸。构建人野生型TR...
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目的筛选K48聚泛素链在肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated facto r 2,T RA F2)上的主要修饰位点。方法比较不同物种间的T RA F2氨基酸序列,选出人T RA F2上保守率在90%以上的赖氨酸。构建人野生型TRAF2的表达载体及保守赖氨酸突变为精氨酸的突变表达载体。将不同的TRAF2表达载体与NF-κB荧光素酶报告基因表达载体共转至293FT细胞中,通过荧光素酶检测NF-κB激活情况。结果人TRAF2上共有8个保守率在90%以上的赖氨酸,酶切及测序结果证明本研究成功构建TRAF2野生型和突变型表达载体。NF-κB荧光素酶报告基因检测证明TRAF2-K320可能是K48聚泛素链的主要修饰位点。结论 TRAF2-K320位点对TRAF2介导的NF-κB激活具有负向调控作用。
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