检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2020年第9期36卷 1732-1740页

作者：朱依凡于少雄仇华吉王翀华南农业大学动物科学学院国家生猪种业工程技术研究中心广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室广东广州510642 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

外泌体是一类小型的细胞外囊泡,可以包裹蛋白质、核酸等生物活性分子随体液循环到达机体各处,具有广泛的信息传递作用。研究发现,外泌体在病毒感染宿主的过程中也扮演着重要的角色。病毒需要在宿主细胞内完成复制周期并释放子代病毒,而... 详细信息

外泌体是一类小型的细胞外囊泡,可以包裹蛋白质、核酸等生物活性分子随体液循环到达机体各处,具有广泛的信息传递作用。研究发现,外泌体在病毒感染宿主的过程中也扮演着重要的角色。病毒需要在宿主细胞内完成复制周期并释放子代病毒,而这一过程与外泌体的产生及分泌途径有共通的部分。一方面,病毒可以"挟持"外泌体并将自身成分装入其中,逃避宿主的免疫应答,促进其在细胞间的传播。另一方面,宿主细胞也可利用外泌体传递抗病毒因子以抑制病毒感染。文中旨在从病毒与宿主两方面阐述外泌体在病毒感染宿主过程中的作用,以期为该领域的研究提供新的思路。

关键词：外泌体病毒免疫逃逸抗病毒作用

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A型流感病毒NP蛋白双单抗夹心ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2020年第6期42卷 572-578页

作者：徐菱张振宇郭兴于萌萌王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立广谱型A型流感病毒(IAV)快速检测方法,本研究选用流感病毒中高度保守的核糖核蛋白(NP)为抗原,采用真核表达系统纯化NP蛋白,并免疫小鼠,按常规方法制备IAV NP蛋白单克隆抗体(MAb)。以制备的SC06 MAb作为捕获抗体,XJ04 MAb作为检测... 详细信息

为建立广谱型A型流感病毒(IAV)快速检测方法,本研究选用流感病毒中高度保守的核糖核蛋白(NP)为抗原,采用真核表达系统纯化NP蛋白,并免疫小鼠,按常规方法制备IAV NP蛋白单克隆抗体(MAb)。以制备的SC06 MAb作为捕获抗体,XJ04 MAb作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IAV NP蛋白的双单抗夹心ELISA方法。结果显示,该检测方法捕获抗体浓度为2 mg/mL,0.1μg/孔,检测抗体浓度为1 mg/mL,0.05μg/孔,NP蛋白浓度在6.07 ng/mL^101.57 ng/mL时与OD450nm呈良好的线性关系,相关系数R2>0.99。该双单抗夹心ELISA方法可以特异性检测多个亚型IAV,特异性强;与血凝试验相比,该双单抗夹心ELISA方法具有很高的灵敏度,可以检测到20 ng/mL的病毒NP蛋白;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好。利用本研究建立的双单抗夹心ELISA方法与RT-PCR方法同时对28份马鼻拭子样品进行检测,结果显示二者总符合率为71.43%。本研究建立的ELISA方法可以用于甲型流感的快速诊断,也可为NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。

关键词： A型流感病毒 NP蛋白双单抗夹心ELISA

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稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系的建立

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中国预防兽医学报 2020年第9期42卷 893-898页

作者：刘燕飞那雷王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系... 详细信息

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系。利用流式细胞分选系统分选及western blot鉴定获得9株HeLa-Cas9单克隆细胞系。为获得具有高效率敲除内源基因的HeLa细胞系,利用同时表达绿色荧光蛋白(GFP)和GFP sgRNA的慢病毒感染HeLa-Cas9单克隆细胞系,经1μg/mL嘌呤霉素培养液筛选一周,流式细胞术检测表达绿色荧光蛋白细胞的百分比,以计算HeLa细胞株的敲除效率,进而建立了一株稳定表达Cas9蛋白的具有高敲除效率的HeLa单克隆细胞系。该细胞的Cas9敲除效率为87%,CCK-8检测结果表明其具有很好的细胞活性。本研究获得的具有高敲除效率的稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系可以用于CRISPR敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选参与特定功能的未知蛋白提供细胞平台。

关键词： Cas9蛋白 HeLa细胞系基因敲除效率

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基于Gluc的马源NLRP3炎症小体激活系统的建立

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中国预防兽医学报 2020年第10期42卷 1039-1044页

作者：王岩刘聪那雷王雪峰林跃智王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立一种快速、敏感的马源NLRP3炎症小体的体外激活检测系统,本研究利用PCR扩增马IL-1β(eqIL-1β)、马Caspase-1(eqCaspase-1)、马ASC(eqASC)和马NLRP3(eqNLRP3),构建重组真核表达质粒pCAGGS-eqIL-1β-flag、pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、pCAGGS-eqCaspase-1-HA、pcDNA3.1-eqASC-HA和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA,分别转染HEK 293T细胞,培养24 h后采用western blot方法检测细胞中各蛋白的表达,结果显示各重组质粒均构建正确,且均在HEK 293T细胞中正确表达;通过质粒共转染HEK 293T细胞依次对NLRP3炎症小体复合物中不同组分进行剂量依赖性试验,培养24 h后采用western blot检测细胞中切割的eqIL-1β蛋白,利用荧光素酶底物检测细胞上清中的荧光强度,结果显示NLRP3炎症小体体外激活系统中各质粒的最适转染剂量分别为pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag 250 ng、pCAGGS-eqCaspase-1-HA 3.12 ng、pcDNA3.1-eqASC-HA 3.12 ng和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 6.25 ng;通过在该系统中加入不同剂量的NLRP3炎症小体激活剂(Nigericin),检测该系统有效性,结果显示细胞中切割的IL-1β蛋白水平以及上清中的荧光强度与Nigericin存在剂量依赖性,表明基于Gluc的马源NLRP3炎症小体体外激活系统正确构建,且其能对马源NLRP3炎症小体激活的相关蛋白和药物进行筛选。本研究建立的马源NLRP3炎症小体的体外激活检测系统为马属动物炎症及炎症小体调控方面的研究提供重要的工具。

关键词： NLRP3炎症小体 IL-1β Gluc

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马M2型CD163单克隆抗体的制备及其在巨噬细胞极化类型检测中的应用

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中国预防兽医学报 2020年第11期42卷 1159-1166页

作者：段盈伊王欣慧陈克伟刘荻萩戚亭郭奎杜承王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

本研究分别采用M1型诱导剂LPS+IFN-γ,M2型诱导剂IL-4或者IL-10刺激马巨噬细胞后,经荧光定量PCR检测巨噬细胞中5种细胞因子和3种表面标记物的转录水平,以确定M1和M2型马巨噬细胞的极比标志物和分泌的细胞因子。为方便快捷地检测马巨噬... 详细信息

本研究分别采用M1型诱导剂LPS+IFN-γ,M2型诱导剂IL-4或者IL-10刺激马巨噬细胞后,经荧光定量PCR检测巨噬细胞中5种细胞因子和3种表面标记物的转录水平,以确定M1和M2型马巨噬细胞的极比标志物和分泌的细胞因子。为方便快捷地检测马巨噬细胞经不同病原感染后的极化表型,本实验截取马巨噬细胞极化标志物CD163基因的SRCR1~SRCR4区域,并分别经原核和真核表达系统表达该重组蛋白CD163。将原核表达的马CD163蛋白免疫小鼠制备CD163的单克隆抗体(MAb),经western blot和激光共聚焦检测该MAb的反应性。以上述实验为基础,采用荧光定量PCR检测不同病原感染巨噬细胞后的3种极化标志物和3种细胞因子基因的转录水平以确定感染后的巨噬细胞的极化表型;将不同病原感染马巨噬细胞24 h后,利用制备的CD163 MAb分别采用流式细胞术检测表达CD163蛋白的马巨噬细胞数量,以及采用western blot检测不同病原感染巨噬细胞后的CD163蛋白的表达量,以进一步鉴定马巨噬细胞的极化状态。荧光定量PCR结果表明,经LPS+IFN-γ诱导后,马巨噬细胞向M1型发生了极化,TNF-α、IL-1β、IL-12、CD80基因可以作为鉴定M1型马巨噬细胞的标记基因;而经IL-4或者IL-10诱导后,马巨噬细胞向M2型发生了极化,TGF-β、IL-10、CD206、CD163基因可以作为鉴定M2型马巨噬细胞的标记基因。MAb western blot和激光共聚焦结果显示,该MAb与真核表达的CD163蛋白以及经IL-10诱导后马巨噬细胞表达的内源性CD163蛋白均能够很好反应,可以用于马巨噬细胞极化状态的检测。荧光定量PCR结果显示,马流产沙门氏菌(*** equi)、马疱疹病毒(EHV-1)和马动脉炎病毒(EAV)感染马巨噬细胞24 h后,M1型细胞因子TNF-α、IL-1β和其表面标记物CD80基因mRNA的转录水平均显著上调(p<0.05),而EIAV感染24 h后,M2型细胞因子IL-10和其表面标记物CD206、CD163基因的mRNA的转录水平均不同程度的上调。表明*** equi、EHV-1和EAV均能诱导马巨噬细胞极化为M1型,并释放大量促炎性因子,而EIAV则可以诱导巨噬细胞极化为M2型,产生了抑炎因子。利用制备的CD163 MAb经流式细胞术和westen blot鉴定结果均表明,在各病原感染早期,EIAV感染可以诱导马巨噬细胞极化为M2型,而其余3种病原未能诱导马巨噬细胞发生M2型的极化。本研究制备了CD163 MAb并利用其检测了不同病原感染后马巨噬细胞极化的表型,丰富了相关疾病发生机制研究的生物学工具。

关键词：马 M2型巨噬细胞 CD163蛋白单克隆抗体

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适合鸭瘟病毒弱毒增殖的MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立

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中国兽医科学 2020年第2期50卷 183-188页

作者：佟相慧问婉欣陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结... 详细信息

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结果显示:F1~F10代均能稳定出现CPE;将F10病毒接种细胞24 h后,通过扫描电镜在胞质、胞核及细胞间隙均能够观察到典型的疱疹病毒粒子;F1至F10代均能扩增出DPV UL2基因片段,序列测定结果表明F1、F5、F10代的扩增产物与NCBI中公布的DPV株(EU082088)的核苷酸同源性为100%;组织培养半数感染量和一步生长曲线结果表明,源自B4系单倍型鸭的DuLMSC细胞系增殖DPV的病毒含量明显高于B1、B2和B3系。本研究为稳定培养鸭瘟病毒提供了优良稳定的实验材料。

关键词：鸭瘟病毒鸭胚肝间充质干细胞主要组织相容性复合体单倍型

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B型流感病毒NP蛋白双单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2020年第8期42卷 779-785页

为建立B型流感病毒(IBV)快速诊断方法,本研究采用真核表达系统表达并纯化了IBV中高度保守的核糖核蛋白(NP),以其为抗原,免疫小鼠制备IBV NP蛋白单克隆抗体(MAb),选取抗原表位长、特异性强的MAb2B3-5作为捕获抗体,选取抗原表位短、灵敏... 详细信息

为建立B型流感病毒(IBV)快速诊断方法,本研究采用真核表达系统表达并纯化了IBV中高度保守的核糖核蛋白(NP),以其为抗原,免疫小鼠制备IBV NP蛋白单克隆抗体(MAb),选取抗原表位长、特异性强的MAb2B3-5作为捕获抗体,选取抗原表位短、灵敏度高的MAb 3C3-7经HRP标记后作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IBV NP蛋白的双MAb夹心ELISA检测方法。结果显示,该检测方法捕获抗体包被量为每孔100 ng,检测抗体使用量为每孔20 ng,NP蛋白浓度在3.9 ng/mL^62.5 ng/mL时与OD450nm呈良好的线性关系,相关系数R2>0.99。利用该ELISA方法对多种病毒进行检测,结果显示该方法仅能与IBV发生反应,表明该方法特异性强;灵敏度试验结果显示,该方法对病毒NP蛋白的最低检测限为13.26 ng/mL,敏感性高;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好;捕获抗体可在25℃和37℃保存4 d,热稳定性好。利用本实验建立的ELISA方法和qPCR方法对本实验室保存的40份人咽拭子进行检测,该方法与qPCR方法相比符合率为70%,表明本研究建立的方法可用于临床检测。本研究建立的ELISA检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为B型流感的快速诊断、NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。

关键词： B型流感病毒 NP蛋白双单克隆抗体夹心ELISA

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我国首次牛结节性皮肤病病毒的分离鉴定撤回

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中国预防兽医学报 2020年

作者：张敏敏孙亚杰刘任强王喜军步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物学国家重点实验室内蒙古农业大学兽医学院

牛结节性皮肤病俗称牛结节疹或牛疙瘩皮肤病（LSD），病原是羊痘病毒属中的牛结节性皮肤病病毒（LSDV）。2019年8月我国首次在新疆伊犁地区发现疑似LSD疫情。本研究无菌采集典型临床症状的病牛病变皮肤组织，接种羊睾丸细胞（LT）细胞... 详细信息

牛结节性皮肤病俗称牛结节疹或牛疙瘩皮肤病（LSD），病原是羊痘病毒属中的牛结节性皮肤病病毒（LSDV）。2019年8月我国首次在新疆伊犁地区发现疑似LSD疫情。本研究无菌采集典型临床症状的病牛病变皮肤组织，接种羊睾丸细胞（LT）细胞进行病毒分离培养，利用透射电镜观察可见砖型痘病毒形态；PCR检测结果为阳性；进一步二代测序（De novo）后对LSDV全基因进行测序分析，结果显示该分离病毒与LSDV/Russia/Saratov/2017（Genbank：MH646674.1）同源性最高，99.42%。系统进化分析显示该病毒与LSDV/Russia/Saratov/2017毒株相似，介于疫苗株和临床分离株分枝之间；采用间接免疫荧光分析，结果显示病毒感染细胞出现亮绿色荧光，初步表明分离到1株LSDV，命名为LSDV/China/Xinjiang/2019株（Xinjiang/2019）。分离病毒感染LT检测其生长特性，结果显示与已报道的山羊痘病毒的生长曲线相似。本研究首次在中国境内分离到LSDV，为该病原传播、致病机制以及疫苗研发奠定了基础。

关键词：牛结节性皮肤病病毒分离鉴定系统发育分析

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猪Cyclin A和CDK2蛋白对猪细小病毒增殖的调控作用

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2020年第8期48卷 19-27页

作者：唐青海杨海彭永刚杨灿何丽芳王芳宇衡阳师范学院生命科学与环境学院畜禽养殖生物工程技术研究所湖南衡阳421008 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

【目的】探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据。【方法】采用RT-PCR扩增pCyclinA和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪... 详细信息

【目的】探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据。【方法】采用RT-PCR扩增pCyclinA和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪睾丸细胞(ST),经新霉素(G418)筛选获得pCyclinA或pCDK2过表达的ST细胞株。设计pCyclinA和pCDK2基因特异性干扰片段(shRNA)CycA894和CDK1163,构建干扰表达载体,转染ST细胞,经G418筛选得到pCyclinA和pCDK2低表达的ST细胞株,实时荧光定量PCR检测其干扰效率。流式细胞术分析pCyclinA和pCDK2过表达和低表达对ST细胞周期的影响。将猪细小病毒NY毒株(PPV-NY)接种过表达和低表达的ST细胞,用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒滴度。【结果】pCyclinA和pCDK2基因的开放阅读框(ORF)分别为1299和897 bp,构建了重组载体pEGFP-pCyclinA和pEGFP-pCDK2。荧光显微镜观察结果显示,融合蛋白EGFP-pCycA和EGFP-pCDK2分别在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中稳定表达。构建了干扰载体pGPU6-GFP/CycA894、pGPU6-GFP/CDK1163和pGPU6-GFP/-shNC(阴性对照);低表达细胞株ST-pGPU6-GFP/CycA894和ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的pCyclinA、pCDK2基因的mRNA表达量均极显著降低(P<0.01)。pCyclinA或CDK2过表达分别极显著或显著降低ST细胞S期的比例(P<0.01或P<0.05)。pCyclinA低表达能极显著降低ST细胞G0/G1期的比例(P<0.01)、极显著增加S期和G2/M期的细胞比例(P<0.01);pCDK2低表达能显著增加ST细胞G0/G1期的比例(P<0.05),但却显著降低S期的细胞比例(P<0.05)。PPV在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中的滴度均极显著低于对照细胞(P<0.01)。低表达细胞ST-pGPU6-GFP/CycA894中PPV滴度极显著增加(P<0.01),而ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的PPV滴度无显著变化(P>0.05)。【结论】pCyclinA或pCDK2过表达均能抑制PPV增殖;pCyclinA低表达可促进PPV增殖,pCDK2低表达对PPV增殖无显著影响;pCyclinA低表达极显著降低G0/G1期细胞比例、但极显著增加S期和G2/M期细胞比例。

关键词：猪Cyclin A 猪CDK2 细胞周期猪细小病毒病毒增殖

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靶向M细胞的抗原递送——增强黏膜免疫应答的关键策略

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生物工程学报 2019年第2期35卷 216-225页

作者：王翌李淼孙元仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

黏膜是阻止病原入侵的第一道防线,黏膜免疫系统在抵抗感染方面起着至关重要的作用。通过黏膜途径接种疫苗可以同时诱导黏膜和全身免疫反应,因此,理论上针对黏膜的免疫策略是最合理和有效的。但黏膜免疫系统的复杂性和屏障作用造成抗原... 详细信息

黏膜是阻止病原入侵的第一道防线,黏膜免疫系统在抵抗感染方面起着至关重要的作用。通过黏膜途径接种疫苗可以同时诱导黏膜和全身免疫反应,因此,理论上针对黏膜的免疫策略是最合理和有效的。但黏膜免疫系统的复杂性和屏障作用造成抗原诱导的免疫应答水平低下,制约了黏膜疫苗的发展。M细胞(Microfoldcells)是黏膜免疫系统所独有的,其具有捕获腔内抗原和启动抗原特异性免疫应答的功能。M细胞摄取抗原的多少直接关系到黏膜疫苗的免疫效力,而利用M细胞配体可将抗原靶向递呈给M细胞,从而实现高效的黏膜免疫应答。靶向M细胞的抗原递送策略及其应用可以提高黏膜免疫应答水平,促进黏膜疫苗的研制。尽管如此,要成功研制安全高效的黏膜疫苗,今后依然有漫长的路要走,这可能有赖于进一步探究M细胞的特性和功能及黏膜免疫机制。

关键词：靶向性抗原递送 M细胞黏膜免疫黏膜疫苗

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