检索结果-内蒙古大学图书馆

利用CRISPR/Cas9技术构建OAS2敲除的PK-15细胞系及敲除OAS2对CSFV复制的影响

中国预防兽医学报 2019年第11期41卷 1094-1098,1105页

作者：张越秀张华伟李连峰仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为研究猪源2’-5’寡腺苷酸合成酶2(OAS2)对CSFV复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除OAS2的PK-15细胞系(PK-OAS2-KO)。在构建PK-OAS2-KO细胞系时,设计2条分别靶向OAS2基因第1和第2外显子的特异性sg RNAs,将sg RNA插入LentiCRISPRv2载体获得重组质粒plentiCRISPRv2-sgRNA;将重组质粒与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装获得携带sg RNA的慢病毒后以MOI 1转导PK-15细胞,通过嘌呤霉素药物筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,经基因测序和western blot鉴定OAS2敲除效果。利用MOI 0.01r CSFV-Rluc株(报告病毒)或CSFV Shimen株分别感染PK15细胞获得的PK-OAS2-KO细胞系,经荧光素酶活性检测和q RT-PCR证实敲除OAS2基因能够促进CSFV复制。综上,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了OAS2基因敲除的PK-15细胞系,并发现OAS2具有抑制CSFV复制的作用,本研究为进一步研究OAS2抗CSFV作用的分子机制提供了依据。

关键词： CRISPR/Cas9 2’-5’寡腺苷酸合成酶2 PK-15 猪瘟病毒

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非洲猪瘟诊断技术发展现状与需求分析

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中国农业科技导报 2019年第9期21卷 1-11页

作者：张丽罗玉子王涛孙元仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus,ASFV)引起猪的一种出血性、高度接触性传染病,其临床症状与猪瘟极其相似。该病于2018年8月在我国辽宁省沈阳市首次发生,随后在31个省份爆发,造成直接经济损失达数百亿元... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus,ASFV)引起猪的一种出血性、高度接触性传染病,其临床症状与猪瘟极其相似。该病于2018年8月在我国辽宁省沈阳市首次发生,随后在31个省份爆发,造成直接经济损失达数百亿元。由于目前尚无有效的商品化疫苗,快速、灵敏、简便的诊断技术对于防控和根除该病至关重要。总结了目前应用的ASFV检测技术,比较分析了他们的性能,同时探讨了ASFV诊断技术未来的发展方向及趋势,旨在为我国ASF检测及综合防控提供技术参考。

关键词：非洲猪瘟病毒诊断技术需求分析

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流感病毒NS1蛋白与宿主蛋白DOK6的相互作用研究

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中国预防兽医学报 2019年第10期41卷 987-992页

作者：黄山雨梁立滨李俊平王倩赵青青周陈陈赵玉辉王广文李奇兵孔凡迪李呈军陈化兰姜丽中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

A型流感病毒非结构蛋白1(NS1)是病毒编码的必需蛋白,在病毒复制周期中发挥重要作用。NS1蛋白在病毒侵入宿主后大量表达,抑制宿主干扰素通路的激活,选择性关闭宿主基因的表达且能够增强病毒蛋白的表达。为研究宿主DOK6蛋白与NS1蛋白的相... 详细信息

A型流感病毒非结构蛋白1(NS1)是病毒编码的必需蛋白,在病毒复制周期中发挥重要作用。NS1蛋白在病毒侵入宿主后大量表达,抑制宿主干扰素通路的激活,选择性关闭宿主基因的表达且能够增强病毒蛋白的表达。为研究宿主DOK6蛋白与NS1蛋白的相互作用关系,本研究利用重组质粒p CAGGS-V5-DOK6、p CAGGS-Flag-NS1共转染293T细胞,利用免疫共沉淀试验(Co-IP)检测,结果显示沉淀NS1蛋白后能够检测到DOK6蛋白条带,表明DOK6蛋白与NS1蛋白存在相互作用;将二者共转染A549细胞后利用激光共聚焦显微镜观察,发现二者在细胞质中存在共定位,表明两种蛋白在细胞质中发生相互作用。通过双分子荧光互补试验(BiFC)检测,结果显示NS1蛋白能够与DOK6蛋白的磷酸化酪氨酸结合结构域(Phosphotyrosine binding domain,PTB)结合从而发出较强荧光,表明NS1蛋白能够与DOK6蛋白(PTB)结构域发生相互作用。本研究进一步完善了A型流感病毒NS1蛋白参与的复杂分子间相互作用网络,为深入理解流感病毒在宿主体内复制的分子调控机制奠定了基础。

关键词：流感病毒 NS1蛋白 DOK6蛋白蛋白相互作用

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猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)——10年回眸

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中国预防兽医学报 2019年第6期41卷 654-659页

作者：韩玉莹李永锋谢利豹仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

1猪瘟及C株疫苗概况猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪的一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的高度传染性疾病,给许多国家的养猪业造成了重大的经济损失[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列入须申报(Notifiable)的动物疫病名录。在... 详细信息

1猪瘟及C株疫苗概况猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪的一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的高度传染性疾病,给许多国家的养猪业造成了重大的经济损失[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列入须申报(Notifiable)的动物疫病名录。在国务院印发的《国家中长期动物疫病防治规划(2012~2020年)》中,将猪瘟列为5种优先防治的“一类动物疫病”之一。

关键词：猪瘟兔化弱毒疫苗 C株世界动物卫生组织动物疫病防治规划传染性疾病经济损失养猪业

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表达EGFP标签的重组血清4型禽腺病毒的构建及评价

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中国兽医科学 2019年第8期49卷 998-1005页

作者：柴冬华邵昱昊李慧昕刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

我国当前流行的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)毒株与国外毒株相比存在自然缺失。为了解我国流行的FAdV-4毒株的复制能力和特点以及病毒毒力的增强机制,本研究以我国当前流行的基因组3′端自然缺失株HN/151025为亲本病毒,采用同源重组技术,在H... 详细信息

我国当前流行的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)毒株与国外毒株相比存在自然缺失。为了解我国流行的FAdV-4毒株的复制能力和特点以及病毒毒力的增强机制,本研究以我国当前流行的基因组3′端自然缺失株HN/151025为亲本病毒,采用同源重组技术,在HN/151025毒株基因组35430~35431自然缺失位点插入EGFP表达盒,构建带有EGFP标签的重组病毒rHN-△35430-EGFP。获得的重组病毒在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,重组病毒在LMH细胞连续传代5代,EGFP基因随病毒的传代而稳定遗传,且EGFP蛋白稳定表达。病毒生长曲线测定结果显示,带有EGFP标签的重组病毒与亲本病毒的生长动力学趋势基本一致,均在接种后第96小时病毒滴度达到高峰,但是重组病毒滴度与亲本病毒差异显著(P<0.05)。对重组病毒感染细胞能力进行评价,结果表明,表达荧光信号的细胞比例从感染后第24小时逐渐增多,至感染后第96小时达到高峰,该结果与病毒生长曲线结果一致。本研究结果表明,FAdV-4病毒基因组3′端可作为标签基因插入位点,为进一步研究病毒复制和感染机制奠定基础。

关键词：禽腺病毒血清4型重组病毒绿色荧光蛋白标签

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动物病毒宏基因组数据分析平台的建立及应用

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中国预防兽医学报 2019年第10期41卷 1041-1046页

作者：史智宾王靖飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

病毒宏基因组学(Viral metagenomics)是一门新兴的用于研究环境及宿主中病毒多样性及其生物学特性学科。为了能够更高效、科学地实现宏病毒组数据分析,本研究建立了一个动物病毒宏基因组数据分析平台。该平台的主要功能包括数据质控、... 详细信息

病毒宏基因组学(Viral metagenomics)是一门新兴的用于研究环境及宿主中病毒多样性及其生物学特性学科。为了能够更高效、科学地实现宏病毒组数据分析,本研究建立了一个动物病毒宏基因组数据分析平台。该平台的主要功能包括数据质控、数据的预处理、序列拼接和序列注释等,并根据应用需求,建立了两种基因序列注释策略:基于读长序列分析和基于重叠序列分析。应用该分析平台对一个猪源鼻拭子的混合样品中病毒基因组数据进行了分析,结果显示该样品中存在环状病毒、冠状病毒、细小病毒等60多种病毒,证明该平台可满足动物病毒宏基因组数据分析的需求。动物病毒宏基因组数据分析平台的建立为动物病毒流行病学监测及疾病防控提供有效的技术手段。

关键词：动物病毒宏基因组读长序列分析重叠序列分析

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基于生长素诱导降解系统条件性敲除弓形虫ATG6蛋白的研究

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中国预防兽医学报 2019年第10期41卷 1015-1020页

作者：陈运通陈赫明付佳雯庞宇郑君贾洪林中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为构建生长素诱导降解系统的弓形虫条件性基因缺失虫株,本研究首先利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选获得Tg Ku80基因缺失虫株,然后采用该缺失虫株,利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选,将生长素诱导降解因子(AID)插入该弓形虫Tg A... 详细信息

为构建生长素诱导降解系统的弓形虫条件性基因缺失虫株,本研究首先利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选获得Tg Ku80基因缺失虫株,然后采用该缺失虫株,利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选,将生长素诱导降解因子(AID)插入该弓形虫Tg ATG6基因序列的5’端得到TgATG6条件性敲除虫株TgATG6-i KD。PCR扩增及测序结果显示,以TgATG6-iKD虫株为模板可扩增出AID标签,而在野生型虫株中,不能有效扩增该靶序列,经测序验证也得到相符结果,表明AID标签序列能够高效定点插入到弓形虫Tg Ku80基因缺失虫株中;通过蛋白免疫印迹试验能够在TgATG6条件性敲除虫株检测到AID标签和TgATG6蛋白的融合表达;蛋白免疫印迹试验及间接免疫荧光实验结果显示,利用生长素(NAA)能够快速诱导融合表达蛋白的降解。本研究通过蛋白N端融合AID共表达,建立了高效条件性敲除弓形虫基因的方法,为进一步研究弓形虫相关基因的功能奠定基础。

关键词：弓形虫植物生长激素条件性敲除 TgATG6

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表达PCV-2 Cap和PPV-1 VP2蛋白的重组PRV的构建及鉴定

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黑龙江畜牧兽医 2019年第5期 16-22,175页

作者：谢永兴夏德利黄立平危艳武吴洪丽朱红振冯力刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的VP2基因(VP2_(opti))和含PRV gG蛋白信号肽序列的VP2_(opti)... 详细信息

为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的VP2基因(VP2_(opti))和含PRV gG蛋白信号肽序列的VP2_(opti)基因分别构建重组质粒pMD18T-LR(TK)-VP2_(opti)和pMD18T-LR(TK)-VP2_(opti)(SP)。用已构建的重组病毒rPRV-TK^-/gE^-/gG^-/3Cap^+为骨架,以EGFP为标签经同源重组获得重组病毒。采用IPMA法鉴定Cap蛋白和VP2蛋白抗原在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达,采用IFA法鉴定VP2蛋白在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达与定位。用这2株重组病毒免疫小鼠,通过检测血清中PRV、PCV-2和PPV-1抗体水平对构建的重组病毒在小鼠体内的免疫原性进行评价。结果表明:经同源重组获得重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+和rPRV-TK^-/VP2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+;在重组病毒感染的PK-15细胞中均能检测到阳性Cap蛋白和VP2蛋白抗原;重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的VP2蛋白定位于细胞浆和细胞核,而重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的VP2蛋白定位于细胞浆;用这2株重组病毒免疫小鼠能够检测到PRV中和抗体;用灭活的重组病毒免疫小鼠后可产生低水平的Cap和VP2抗体,而重组病毒活毒免疫的小鼠未检测到相应抗体。说明这2株重组病毒在体外能够表达Cap蛋白和VP2蛋白,PRV gG蛋白信号肽序列的加入促进了VP2蛋白从细胞核的释放。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白猪细小病毒1型 VP2蛋白重组伪狂犬病病毒重组质粒免疫原性

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A型流感病毒感染雪貂造模的研究进展

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中国实验动物学报 2019年第2期27卷 254-260页

作者：马树杰张博孔宇飞关云涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染人和动物,严重威胁公共卫生安全。动物模型在IAV研究中发挥着重要作用,不同的动物模型具有不同的优点和限制性。本文比较了雪貂与小鼠、豚鼠和非人灵长类动物模型的优点和限制性,突出说明雪貂在... 详细信息

A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染人和动物,严重威胁公共卫生安全。动物模型在IAV研究中发挥着重要作用,不同的动物模型具有不同的优点和限制性。本文比较了雪貂与小鼠、豚鼠和非人灵长类动物模型的优点和限制性,突出说明雪貂在IAV研究中的重要性,并就雪貂在IAV致病性、传播和疫苗研发中的研究进展做了总结,以期为IAV的基础和应用研究提供参考。

关键词： A型流感病毒雪貂动物模型致病性传播疫苗研发

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抗菌肽Sublancin对蛋鸡免疫功能的影响研究

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中国预防兽医学报 2020年第3期42卷 268-273页

作者：田丽娜王秀荣李广兴东北农业大学动物医学学院/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究抗菌肽Sublancin对蛋鸡免疫功能的调节作用,本研究将216只海兰褐壳蛋鸡随机分为对照组(饲喂基础饲粮,C组)、低剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+100 mg/kg Sublancin,L组)、中剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+200 mg/kg Sublancin,M组)和高... 详细信息

为研究抗菌肽Sublancin对蛋鸡免疫功能的调节作用,本研究将216只海兰褐壳蛋鸡随机分为对照组(饲喂基础饲粮,C组)、低剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+100 mg/kg Sublancin,L组)、中剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+200 mg/kg Sublancin,M组)和高剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+300 mg/kg Sublancin,H组)进行抗菌肽调控蛋鸡免疫的实验。实验持续30 d,分别在饲喂Sublancin后第1 d、15 d和30 d用ELISA试剂盒检测每组鸡血清中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM含量;检测肝脏和脾脏指数;利用免疫印迹法检测每组鸡脾脏中干扰素γ(IFN-γ)表达;利用ELISA试剂盒检测每组鸡血清中IL-2、IL-4和IL-6含量。结果显示:与C组比较,L组、M组和H组鸡血清中IgA、IgG和IgM含量、肝脏和脾脏指数、脾脏中IFN-γ的表达、血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量在饲喂Sublancin后第1 d均无显著变化(p>0.05),在饲喂Sublancin后第15 d和第30 d均显著升高(p<0.05);与L组比较,M组和H组中上述检测指标在饲喂Sublancin后第15 d和第30 d均显著升高(p<0.05);与M组比较,H组中上述检测指标在饲喂Sublancin后第15 d和第30 d均无显著变化(p>0.05)。实验表明饲粮中添加抗菌肽Sublancin可以显著增强蛋鸡免疫力,其添加浓度在100 mg/kg^200 mg/kg时,作用效果有剂量依赖性;但添加浓度在200 mg/kg^300 mg/kg时,作用效果与浓度无关。本研究为家禽养殖业中功能性饲料添加剂的开发及抗菌肽Sublancin在养殖业中的应用提供了新的参考依据。

关键词：抗菌肽 Sublancin 蛋鸡免疫功能

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