检索结果-内蒙古大学图书馆

养殖与饲料 2020年第11期19卷 15-18页

作者：张元峰刘锡玲毕路李佳方瑞李乾赵俊龙毕丁仁黄丽步志高翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 武汉观锐生物科技有限公司武汉430070 武汉科维创生物科技有限公司武汉430014

本研究采用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测倍比稀释后的非洲猪瘟病毒标准阳性血清,将标准阳性血清倍比稀释至1∶256时,试纸卡检测线仍呈现清晰的、肉眼可见的红色沉淀线;标准阴性血清、空载体血清及其他无关病毒阳性血清各稀释度均无... 详细信息

本研究采用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡检测倍比稀释后的非洲猪瘟病毒标准阳性血清,将标准阳性血清倍比稀释至1∶256时,试纸卡检测线仍呈现清晰的、肉眼可见的红色沉淀线;标准阴性血清、空载体血清及其他无关病毒阳性血清各稀释度均无沉淀线。检测已知感染猪血清时,最早感染后第8天即能查出阳性抗体,与ELISA检测结果一致。用非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡对230份送检猪血清中的非洲猪瘟抗体进行检测,并与西班牙INGENASA非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒进行比较试验。试验结果显示,阳性符合率为80%,阴性符合率为89.2%,总符合率为84.8%,说明本试验所制备的试纸卡在检测非洲猪瘟病毒抗体的临床应用中特异性强、准确度高,与常规ELISA试剂盒比较,能更快、更便捷地查出猪群中非洲猪瘟病毒抗体阳性猪,更适合于普通实验室及养殖单位现场临床应用。

关键词：非洲猪瘟抗体检测胶体金检测试纸卡病毒抗体

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自噬相关基因Atg3在埃博拉病毒组装过程中的作用研究

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病毒学报 2019年第6期35卷 888-894页

作者：刘鑫王斌姚晓雨郑永辉范春玲黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆 163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所‐美国密歇根州立大学天然免疫联合实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨 150001

自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研... 详细信息

自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研究首先根据CRISPR/Cas9技术构建了携带有Atg3基因靶向向导RNA(guide RNA,gRNA)、表达Cas9的重组质粒pSpCas-Atg3,将此质粒转染至人胚胎肾细胞293T中,之后采用流式分选结合有限稀释法筛选单细胞克隆。细胞基因测序及Western Blot试验表明成功获得了Atg3基因敲除的细胞系。在Agt3基因敲除细胞系和野生型细胞中分别共同转染表达EBOV囊膜蛋白(Glycoprotein,GP)和基质蛋白的重组质粒,包装病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP);同时在两种细胞中组装整合有EBOV的重组HIV假病毒,获得的假病毒感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),通过测定报告基因的活性判定病毒对细胞的侵入能力。结果显示Atg3基因缺失后,VLP所整合的GP蛋白显著增多,假病毒对细胞的侵染能力也明显增强(P<0.001),表明Agt3能够负调控EBOV的组装和入侵。本研究为开发新抗病毒药物提供了新思路。

关键词：自噬(Autophagy) 自噬相关基因3(Atg3) 埃博拉病毒(EBOV) 囊膜蛋白(GP)

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水貂阿留申病毒VP2基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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实验动物与比较医学 2020年第4期40卷 289-295页

作者：闫文卓陆涛峰周洁赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069 贵州中医药大学实验动物研究所贵阳550025 上海实验动物研究中心上海201203

目的建立一种方便、灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)荧光定量PCR检测方法,从而实现临床样品中AMDV的快速定量检测。方法根据AMDV的结构蛋白VP2的基因保守区域设计一对特异性引物和探针,优化PCR反应条件,建立TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,... 详细信息

目的建立一种方便、灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)荧光定量PCR检测方法,从而实现临床样品中AMDV的快速定量检测。方法根据AMDV的结构蛋白VP2的基因保守区域设计一对特异性引物和探针,优化PCR反应条件,建立TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,绘制标准曲线,并进行特异性、敏感性和稳定性分析。结果建立的标准曲线在1.0×10^2拷贝/μL至1.0×10^8拷贝/μL之间具有良好的线性关系,相关系数(r^2)大于0.994。该方法检测的灵敏度为10^2拷贝/μL,且与犬细小病毒、犬腺病毒、犬瘟热病毒和水貂病毒性肠炎病毒均无明显交叉反应,特异性良好。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于3%,重复性良好。利用该方法对417份临床组织样品进行检测的结果显示,中国部分地区的AMDV阳性率为81.5%。结论本研究建立了一种重复性、特异性和敏感性良好的AMDV荧光定量PCR检测方法,可用于AMDV的临床检测和流行病学调查。

关键词：水貂阿留申病水貂阿留申病毒实时荧光定量PCR VP2 检测方法

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敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

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中国动物传染病学报 2019年第5期27卷 14-21页

作者：许曼黄立平邵玉乐夏德利曾为俊王辉鲁国涛刘长明陈洪岩王金泉孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sgRNA,构建重组载体pUC19-RIG-I-sgRNA1和pUC19-RIG-I-sgRNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9基因编辑视黄酸诱导基因Ⅰ信号通路 PK-15 猪圆环病毒2型

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PB2蛋白E627V突变可增强H7N9病毒对小鼠的致病力

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中国农业科学 2018年第17期51卷 3379-3388页

作者：尹馨马树杰李梅邓国华侯玉杰崔鹏飞施建忠陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室

【背景】低致病性H7N9病毒自2013年在我国首次出现以来,研究发现其对家禽均呈现低致病力,对哺乳动物模型小鼠也不表现任何的致病力。但是,2015年在湖南分离的1株低致病性H7N9病毒(简称HuN/S40726),却对哺乳动物小鼠表现为高致病力。分... 详细信息

【背景】低致病性H7N9病毒自2013年在我国首次出现以来,研究发现其对家禽均呈现低致病力,对哺乳动物模型小鼠也不表现任何的致病力。但是,2015年在湖南分离的1株低致病性H7N9病毒(简称HuN/S40726),却对哺乳动物小鼠表现为高致病力。分析、推测导致该病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。【目的】为了揭示该病毒致病力的变化原因以及对哺乳动物致病性增强的机制,提供人类H7N9病毒感染、危害增强风险预警,展开该研究。【方法】选取2013年低致病性H7N9病毒代表株(简称SH/S1053)和上述湖南HuN/S40726病毒,开展了哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析。然后以HuN/S40726病毒为模式毒株,利用反向遗传学技术,成功建立了病毒的反向遗传操作系统;利用基因点突变技术定点突变了HuN/S40726病毒PB2蛋白的627位氨基酸,救获了重组病毒r HuN/S40726、r HuN/S40726-PB2/627E和r HuN/S40726-PB2/627K。通过小鼠感染模型评估了以上3株重组突变病毒对哺乳动物的致病力,分析了PB2蛋白627位氨基酸的突变对小鼠致病力的差异。然后通过构建HuN/S40726病毒及其突变病毒的聚合酶复合表达质粒系统,以SH/S1053病毒为背景毒株构建聚合酶复合表达质粒系统作为对照,使用双荧光素酶法检测了PB2蛋白627位氨基酸的不同突变体在293T细胞中的聚合酶活性,进一步分析PB2蛋白627位氨基酸影响病毒毒力的内在机制。【结果】通过哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析,推测导致HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。重组救获病毒和突变株对小鼠致病性试验结果显示,PB2蛋白E627V的改变显著的增强了HuN/S40726病毒对小鼠的致病力,使得病毒MLD50由≥6.5 log10EID50变化为3.5 log10EID50,病毒毒力增强了至少1 000倍以上。聚合酶活性试验结果表明,无论是在33℃还是37℃下,PB2蛋白E627V的改变,显著提高了HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,与病毒对小鼠的致病性增强呈正相关性。【结论】PB2蛋白627位氨基酸(V)决定了HuN/S40726病毒对小鼠的高致病力。PB2蛋白E627V的改变能够显著增强HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,是引起HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力的重要因素。

关键词： H7N9 PB2 E627V 致病力聚合酶活性

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USP18分子通过Ⅰ型干扰素通路影响猪瘟病毒复制的研究

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中国预防兽医学报 2019年第5期41卷 455-461页

作者：王文静李素王竞晗仇华吉肖书奇西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

猪瘟病毒(CSFV)感染无特定病原(SPF)猪后,分离猪外周血单个核细胞进行转录组分析,数据显示病毒感染后泛素特异性蛋白酶18(USP18)基因的转录水平明显上升。为研究USP18分子对CSFV复制的影响及其作用机制,本研究通过构建过表达USP18的细... 详细信息

猪瘟病毒(CSFV)感染无特定病原(SPF)猪后,分离猪外周血单个核细胞进行转录组分析,数据显示病毒感染后泛素特异性蛋白酶18(USP18)基因的转录水平明显上升。为研究USP18分子对CSFV复制的影响及其作用机制,本研究通过构建过表达USP18的细胞系及应用特异性小干扰RNA下调表达USP18的方法,采用荧光定量PCR验证USP18对CSFV增殖的影响,结果显示USP18分子能够促进CSFV的复制;通过检测IFN-β、NF-κB及ISRE的启动子活性及I型干扰素(IFN-I)信号通路的下游分子m RNA的转录水平,采用荧光定量PCR和双荧光酶报答试验分析USP18对IFN-I信号通路的影响,结果显示USP18分子抑制IFN-I信号通路。以上结果表明CSFV通过诱导USP18分子的上调表达,抑制了IFN-I途径,从而逃避天然免疫防御,进而促进自身的复制。本研究为明确CSFV与宿主之间的相互作用及CSFV致病机制提供参考依据和奠定基础。

关键词： USP18 猪瘟病毒 Ⅰ型干扰素天然免疫

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非洲猪瘟——我国养猪业的重大威胁

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中国农业科学 2018年第21期51卷 4177-4187页

作者：罗玉子孙元王涛仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家猪和野猪引起的一种烈性传染病,急性型临床上表现为高热、沉郁、厌食、皮肤发绀、各脏器出血,发病率和病死率可高达100%。世界动物卫生组织... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家猪和野猪引起的一种烈性传染病,急性型临床上表现为高热、沉郁、厌食、皮肤发绀、各脏器出血,发病率和病死率可高达100%。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病,是我国重点防范的外来动物疫病之一。ASF在撒哈拉以南的非洲地区、意大利撒丁岛、高加索地区以及俄罗斯和东欧部分国家流行,给疫区国家的养猪业造成巨大的经济损失,并严重冲击畜产品的国际贸易。2018年8月,ASF首次传入我国,随后迅速大范围蔓延,对我国养猪业构成重大威胁,防控形势异常严峻。随着经济全球化发展,ASF呈全球流行态势,持续传入我国的风险极高。鉴于目前无商业化的ASF疫苗,亟需研发可实现现场快速检测的早期诊断技术,做到对疫情早发现、早控制。由于ASFV具有庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制,使得研制有效的疫苗十分困难。目前研制的灭活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗不能提供免疫保护或仅能提供部分保护,而减毒活疫苗和基因缺失疫苗可以诱导完全的同源保护和部分的交叉保护。未来需要深入解析病毒毒力相关基因和免疫保护性相关抗原,并着力研制基因缺失疫苗和弱毒疫苗,解决其安全性、稳定性和免疫效力等难题。本文就ASF的流行病学、诊断技术和疫苗研发等方面的最新研究进展及防控面临的挑战进行综述,并提出防控策略及建议,以期为我国ASF的防控提供参考。

关键词：非洲猪瘟中国流行病学诊断疫苗防控策略

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CRISPR技术在病毒学研究中的应用

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中国动物检疫 2020年第6期37卷 60-67页

作者：高帅李芳李赞王涛赵东明步志高天津大学生命科学学院天津300072 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 国家动物疫病防控高级别生物安全实验室黑龙江哈尔滨150069

近年来,CRISPR/Cas系统凭借其操作简单、靶向精准、效率高等优点,在生物学领域的应用潜力备受关注。通过总结CRISPR技术在抗病毒药物潜在靶点筛选、疫苗开发、病毒核酸快速检测、病毒性疾病临床治疗等领域的应用,阐明了CRISPR/Cas系统... 详细信息

近年来,CRISPR/Cas系统凭借其操作简单、靶向精准、效率高等优点,在生物学领域的应用潜力备受关注。通过总结CRISPR技术在抗病毒药物潜在靶点筛选、疫苗开发、病毒核酸快速检测、病毒性疾病临床治疗等领域的应用,阐明了CRISPR/Cas系统目前面临的挑战及相应的解决措施。作为一种基因编辑技术,CRISPR/Cas系统可以快捷地筛选出多种病毒的潜在药物靶点;可以改造病毒基因组,为研发基因缺失活疫苗做储备;可以快速准确诊断病毒性疾病,也可以为乙肝、艾滋病等病毒性疾病的治疗提供新方向。CRISPR/Cas系统仍存在致癌风险、脱靶效应以及递送系统的安全准确性不足等问题。随着CRISPR技术的不断完善,该技术必将会给病毒性疾病的检测诊断与预防控制带来重大变革。

关键词： CRISPR 病毒疫苗开发核酸检测临床研究

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正交试验法在优化重组乳酸乳球菌诱导表达中的应用研究

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中国家禽 2019年第5期41卷 25-28页

作者：张园王文骞宋雨心王婷婷刘琳琳崔红玉何高明石河子大学动物科技学院新疆石河子832002 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为提高重组乳酸菌NICE诱导表达系统表达外源蛋白的能力,研究选取Nisin加入量、OD值、诱导温度和诱导时间这4个主要影响表达的因素,每个因素设置3个水平,设计4因素3水平(43)正交试验。通过优化Nisin加入量、OD值、诱导温度和诱导时间,从... 详细信息

为提高重组乳酸菌NICE诱导表达系统表达外源蛋白的能力,研究选取Nisin加入量、OD值、诱导温度和诱导时间这4个主要影响表达的因素,每个因素设置3个水平,设计4因素3水平(43)正交试验。通过优化Nisin加入量、OD值、诱导温度和诱导时间,从而确定重组乳酸菌表达外源蛋白最佳条件。结果显示:当Nisin的量为1 ng/mL、OD值为0.3、诱导温度为30℃、诱导时间为7 h时,其重组乳酸菌表达外源蛋白的量最高。研究结果为由Nisin控制表达基因系统的重组乳酸乳球菌疫苗开发奠定了基础。

关键词：重组乳酸乳球菌正交试验法诱导表达

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伪狂犬病病毒UL56蛋白与宿主蛋白Nedd4相互作用的研究

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中国预防兽医学报 2019年第6期41卷 553-559页

作者：王书文吕闯蔡雪辉吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

伪狂犬病病毒(PRV)UL56蛋白(pUL56)属于Ⅱ型膜蛋白。近期研究结果表明PRVpUL56与PRV对啮齿动物的致病性相关。为揭示PRVpUL56与宿主相互作用的分子基础,本研究通过免疫共沉淀(Co-IP)试验确定了pUL56与神经前体细胞表达的发育下调蛋白4(N... 详细信息

伪狂犬病病毒(PRV)UL56蛋白(pUL56)属于Ⅱ型膜蛋白。近期研究结果表明PRVpUL56与PRV对啮齿动物的致病性相关。为揭示PRVpUL56与宿主相互作用的分子基础,本研究通过免疫共沉淀(Co-IP)试验确定了pUL56与神经前体细胞表达的发育下调蛋白4(Nedd4)存在相互作用。进一步,利用激光共聚焦试验确定过表达pUL56与Nedd4在转染HEK293T细胞的高尔基体存在共定位。通过互作,pUL56可以将细胞质分布的Nedd4重新定位于高尔基体。前期研究表明,含有WW结构域的宿主蛋白可以与含有PPxY(PY)基序的病毒蛋白互作。因此,本研究构建了pUL56PY基序丙氨酸突变体(PPxY/AAxY),利用Co-IP试验对pUL56突变体和Nedd4相互作用进行验证,结果表明随着pUL56PY基序突变的增加,蛋白互作能力逐渐减弱。此外,pUL56通过其PY基序显著下调Nedd4的表达。这些结果证实了PRVpUL56与Nedd4主要通过WW结构域/PY基序模式发挥相互作用,并下调Nedd4的表达。因此,本研究为阐明PRVpUL56与宿主相互作用的分子机制提供了参考依据。

关键词：伪狂犬病病毒 pUL56 高尔基体 Co-IP 蛋白互作

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