检索结果-内蒙古大学图书馆

基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台:发掘病毒复制相关宿主分子的新途径

微生物学报 2018年第11期58卷 1897-1907页

作者：王文静李素肖书奇仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

病毒作为严格的细胞内寄生生物,需要多种宿主蛋白辅助其完成生命周期。寻找与病毒复制相关的宿主因子并揭示其作用机制,将有助于阐明病毒的感染机制,为疫病的防治提供新靶标。与RNA干扰技术相比,近年来兴起的CRISPR/Cas9技术能更特异、... 详细信息

病毒作为严格的细胞内寄生生物,需要多种宿主蛋白辅助其完成生命周期。寻找与病毒复制相关的宿主因子并揭示其作用机制,将有助于阐明病毒的感染机制,为疫病的防治提供新靶标。与RNA干扰技术相比,近年来兴起的CRISPR/Cas9技术能更特异、高效、准确地实现基因组编辑,因而在功能基因研究中得到更广泛应用。而基于CRISPR/Cas9系统的宿主全基因组sgRNA文库高通量筛选技术平台,可快速发现参与病毒侵入、复制等生物学过程的关键宿主因子,通过明确病毒-宿主分子相互作用进而揭示病毒的生命周期,为分子病毒学和免疫学提供了强大的研究工具。本文主要总结了基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台的具体筛选流程,归纳和讨论了该平台在筛选调控病毒复制相关宿主因子中的应用现状和发展前景。

关键词： CRISPR/Cas9 高通量筛选 sgRNA文库病毒-宿主相互作用宿主因子

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慢病毒与microRNA研究进展

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中国预防兽医学报 2018年第9期40卷 862-867页

作者：韩亚儒杜承王晓钧内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

MicroRNA （miRNA）作为一类重要的调控分子广泛存在于动植物体内并且对调控基因表达有着重要的作用。miRNA是一类高度保守且长度为18-25个核苷酸（nt）的小分子,它不编码蛋白质但却可以通过与蛋白编码基因的mRNA互补结合调控基因的表... 详细信息

MicroRNA （miRNA）作为一类重要的调控分子广泛存在于动植物体内并且对调控基因表达有着重要的作用。miRNA是一类高度保守且长度为18-25个核苷酸（nt）的小分子,它不编码蛋白质但却可以通过与蛋白编码基因的mRNA互补结合调控基因的表达。在植物中,通过完全配对结合靶基因而裂解靶mRNA;动物中,通过与靶基因不完全配对结合而抑制蛋白质的翻译。

关键词：基因组宿主细胞 microRNA 病毒编码 HIV 疱疹病毒自身复制编码基因 SIV 研究进展

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稳定表达人、马Tetherin蛋白的MDCK细胞系的构建及其限制流感病毒活性的研究

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中国预防兽医学报 2018年第7期40卷 626-629页

作者：王美月张振宇王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为评估人、马Tetherin(hu Tetherin、eq Tetherin)限制流感病毒的活性,本研究将huTetherin、eqTetherin克隆于慢病毒表达载体pLPCX中,分别构建重组质粒pLPCX-HA-hu Tetherin、pLPCX-HA-eqTetherin,并构建pLPCX-HA作为阴性对照。将上述构建的重组质粒,pVSV-G以及pcGP共转染293T细胞,获得假病毒后感染MDCK细胞,并利用嘌呤霉素筛选、纯化,建立稳定表达huTetherin和eqTetherin的MDCK细胞系。经western blot鉴定显示,该细胞系中huTetherin和eqTetherin可稳定表达。以反向遗传救获的马流感病毒(A/equine/Jilin/1/1989)(JL89)感染这两种细胞系,结果显示eqTetherin和huTetherin均对该流感病毒株具有显著限制作用。该研究为进一步评价和探索huTetherin和eqTetherin限制流感病毒的作用和机制奠定了基础。

关键词：人、马Tetherin MDCK细胞系流感病毒

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STAT3在猪流行性腹泻病毒感染的作用及机制初步探索撤回

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中国预防兽医学报 2018年

作者：杨丽君郭龙军张健许嘉宇张璐冯力陈洪岩王玉娥中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物与比较医学团队/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

为探究信号传导及转录激活因子3（STAT3）在猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染过程中的作用,本研究采用STAT3特异性si RNA处理HEK293和IPEC细胞,作用24 h后,通过荧光定量PCR和western blot检测结果显示其能够明显降低STAT3的m RNA水平和蛋... 详细信息

为探究信号传导及转录激活因子3（STAT3）在猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染过程中的作用,本研究采用STAT3特异性si RNA处理HEK293和IPEC细胞,作用24 h后,通过荧光定量PCR和western blot检测结果显示其能够明显降低STAT3的m RNA水平和蛋白水平;在此条件下接种PEDV,通过荧光定量PCR检测,显示当STAT3的m RNA水平降低时能够显著抑制PEDV的RNA水平,western blot实验结果也显示抑制STAT3内源性表达能够显著抑制PEDV复制。为进一步研究STAT3的作用机制,采用STAT3特异性si RNA处理这两种细胞,24 h后经过荧光定量PCR检测发现敲低STAT3后,干扰素刺激基因Mx A、ISG15以及IFN-β,IFN-λ的m RNA水平均显著升高。本研究对于进一步阐明STAT3参与PEDV感染引发的IFN抗病毒反应提供了实验依据。

关键词： STAT3 PEDV IFN

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马抗中东呼吸综合征冠状病毒特异性F(ab’)_2的制备

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中国生物制品学杂志 2019年第2期32卷 173-180页

作者：邱泊宁胡星星闫飞虎王翀崔健男盖微微曹增国王化磊赵永坤杨松涛夏咸柱吉林大学动物医学学院吉林长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

目的采用免疫亲和层析技术纯化制备马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)特异性IgG与F(ab’)_2。方法以经MERS-Co V病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,原核表达的MERS-CoV刺突蛋白S受体结合域(S-receptor binding domain,S-RBD)为抗原蛋白制备免疫亲和柱,提取制备抗原特异性IgG或F(ab’)_2。间接ELISA法检测各样品的活性,MERS假病毒中和试验检测样品的中和活性,BCA法测定样品的浓度,并计算收率。结果所制备的特异性IgG与特异性F(ab’)2的纯度分别为90. 1%和92. 8%,收率分别为8. 7%和3. 07%;在相同的浓度下,所制备的特异性IgG或F(ab’)_2的活性和中和活性均高于对照组中的血清总Ig G或总F(ab’)_2。结论成功制备了马抗MERS-CoV特异性IgG或F(ab’)_2,为建立更加安全与高效的抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2制备工艺奠定了基础。

关键词：中东呼吸综合征冠状病毒病毒样颗粒免疫亲和层析免疫球蛋白 F(ab’)2

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猪脑心肌炎病毒3AB蛋白与宿主蛋白RPL11相互作用的鉴定

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中国预防兽医学报 2018年第5期40卷 375-380页

作者：薛娟张昆丽张元峰黄丽杨玉莹翁长江长江大学动物科学学院湖北荆州434025 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基础免疫创新团队/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了研究与猪脑心肌炎病毒(EMCV)3AB相互作用的宿主蛋白,本实验采用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞cDNA酵母表达文库,获得6个与EMCV 3AB相互作用的宿主蛋白(RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20和LGALS1),经分析显示这些蛋白分别参与DNA... 详细信息

为了研究与猪脑心肌炎病毒(EMCV)3AB相互作用的宿主蛋白,本实验采用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞cDNA酵母表达文库,获得6个与EMCV 3AB相互作用的宿主蛋白(RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20和LGALS1),经分析显示这些蛋白分别参与DNA复制、有丝分裂和细胞凋亡等过程;酵母共转化试验与免疫共沉淀试验证实EMCV 3AB和RPL11两者之间存在特异性结合;激光共聚焦试验显示EMCV 3AB与RPL11共同过度表达时,二者共定位在细胞核中,而在EMCV感染状态下,3AB与RPL11主要共定位在细胞质中。另外,EMCV感染HeLa细胞能降低细胞中p53的蛋白水平,但3AB并不直接促进p53蛋白降解,表明EMCV 3AB对RPL11-MDM2-p53通路无影响。本研究发现并证实了RPL11与EMCV 3AB之间的相互作用,为进一步研究RPL11蛋白在EMCV复制中的作用奠定了基础。

关键词：猪脑心肌炎病毒 3AB蛋白 60S核糖体蛋白L11 病毒-宿主相互作用

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不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白的比较分析

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中国家禽 2018年第7期40卷 14-17页

作者：张莹刘琳徐海峰曾显营施建忠王秀荣陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为明确高致病性和低致病性H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的血清学特性是否有差异,通过体外表达两种H7N9亚型流感病毒HA蛋白并进行分析。利用RT-PCR方法扩增出高、低致病性H7N9亚型流感病毒HA基因,测序,并克隆于真核表达载体pCAGGS-Fla... 详细信息

为明确高致病性和低致病性H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的血清学特性是否有差异,通过体外表达两种H7N9亚型流感病毒HA蛋白并进行分析。利用RT-PCR方法扩增出高、低致病性H7N9亚型流感病毒HA基因,测序,并克隆于真核表达载体pCAGGS-Flag中,构建两个重组表达质粒,命名为pCAF-H7HPHA和pCAF-H7LPHA,分别转染293T细胞,用间接免疫荧光试验和Western blot试验观察HA蛋白的表达情况。结果显示:与低致病H7N9亚型流感病毒比较,高致病性H7N9亚型流感病毒HA基因裂解位点有连续的碱性氨基酸插入,糖基化位点和受体结合位点没有差异。不同致病性毒株的HA蛋白均能表达良好,表达蛋白分子量约为70 ku;高致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白(或血清)可以与低致病H7N9流感血清(或蛋白)发生反应。结果表明:不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白在血清学上没有差异性,为H7N9亚型流感病毒HA蛋白的研究奠定基础。

关键词： H7N9亚型流感 HA蛋白血清学

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亲环蛋白A对动物病毒感染的调控及其分子机制

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畜牧兽医科技信息 2019年第7期35卷 4-6页

作者：吴甜甜王笑梅祁小乐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 江苏省动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心江苏扬州225009

传统的抗病毒策略多以病毒自身为靶点,随着天然免疫研究的不断深入,宿主的一系列抗病毒靶点相继被鉴定。亲环蛋白A(Cyclophilin A, CypA)是亲环蛋白(Cyclophilins, Cyps)家族中含量最丰富、被研究最多的一个成员。CypA不仅具有多种生理... 详细信息

传统的抗病毒策略多以病毒自身为靶点,随着天然免疫研究的不断深入,宿主的一系列抗病毒靶点相继被鉴定。亲环蛋白A(Cyclophilin A, CypA)是亲环蛋白(Cyclophilins, Cyps)家族中含量最丰富、被研究最多的一个成员。CypA不仅具有多种生理功能,也广泛参与到多种病毒的感染过程中,其作为抗病毒制剂的靶点近来也不断被关注。本文综述了CypA对不同动物病毒感染的调控作用及其分子机制,对于新型抗病毒策略的探索具有重要意义。

关键词：亲环蛋白A 动物病毒抗病毒

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感染马传染性贫血病毒的巨噬细胞差异表达microRNA分析

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中国预防兽医学报 2018年第8期40卷 665-669页

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)感染靶细胞-马单核巨噬细胞(eMDM)后细胞内microRNA (miRNA)表达的变化,本研究采用EIAV强毒株EIAVDLV34感染eMDM,并以未感染组作为对照,提取细胞内总RNA,通过高通量测序分析细胞内miRNA表达谱的变化。结果... 详细信息

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)感染靶细胞-马单核巨噬细胞(eMDM)后细胞内microRNA (miRNA)表达的变化,本研究采用EIAV强毒株EIAVDLV34感染eMDM,并以未感染组作为对照,提取细胞内总RNA,通过高通量测序分析细胞内miRNA表达谱的变化。结果显示,与对照相比,感染EIAVDLV34后eMDM有16个miRNA发生差异表达,其中8个miRNA上调表达,8个miRNA下调表达,通过荧光定量PCR技术对这16个miRNA的表达进行了验证,结果与高通量测序一致,最后利用生物信息学方法对这16个miRNA的靶基因及其参与的生物学过程进行了分析,显示靶基因主要参与转录调控、信号转导、细胞凋亡等生物学过程。本研究为进一步分析EIAV与其宿主相互作用、致病机制以及慢病毒相关疾病的预防提供了参考依据。

关键词：马传染性贫血病毒 microRNA 差异表达生物信息学

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体外弓形虫感染小鼠小胶质细胞及对其极化的影响

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中国预防兽医学报 2018年第3期40卷 243-247页

作者：陈立思胡守萍张交儿张卓刘强贾洪林王龙涛何希君吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为探究体外弓形虫(***)感染小鼠小胶质细胞(Microglia)后对其极化的影响,将PLK株弓形虫接种原代小胶质细胞,分别在弓形虫感染细胞后6 h、12 h、24 h、36 h以及48 h收集细胞及培养上清,利用荧光定量PCR、western blot分别检测小胶质细胞M... 详细信息

为探究体外弓形虫(***)感染小鼠小胶质细胞(Microglia)后对其极化的影响,将PLK株弓形虫接种原代小胶质细胞,分别在弓形虫感染细胞后6 h、12 h、24 h、36 h以及48 h收集细胞及培养上清,利用荧光定量PCR、western blot分别检测小胶质细胞M1型以及M2型标记分子的表达水平。采用Griess法和精氨酸酶活性试验分别检测细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arginase-1)的酶活性。结果显示,弓形虫感染细胞后M1型标记分子iNOS与IL-6的mRNA转录水平与蛋白水平均显著上调(p<0.001),而M2型标记分子Arginase-1与IL-10无明显变化(p>0.05)。此外,酶活性检测结果显示iNOS在弓形虫感染6 h～48 h与对照组相比其表达水平有显著差异(p<0.001),而Arginase-1在该时间段表达差异并不显著。本研究结果表明,弓形虫感染小胶质细胞后能够明显诱导静息状态的小胶质细胞向M1型极化,从而改变小胶质细胞的表型和生物学功能,本研究为进一步阐明弓形虫与机体免疫系统相互作用提供了依据。

关键词：弓形虫小胶质细胞极化

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