检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学报 2008年第6期48卷 811-817页

作者：兰德松石星明王云峰崔红玉刘长军王玫胡文玮童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 河北北方学院动物科技学院动物医学系张家口075131

火鸡疱疹病毒(HVT)为一种α疱疹病毒,因其与马立克氏病病毒(MDV)抗原相关性而被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗。【目的】本研究的目的是构建HVT全基因组感染性细菌人工染色体(BAC)。【方法】利用Eco-gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移... 详细信息

火鸡疱疹病毒(HVT)为一种α疱疹病毒,因其与马立克氏病病毒(MDV)抗原相关性而被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗。【目的】本研究的目的是构建HVT全基因组感染性细菌人工染色体(BAC)。【方法】利用Eco-gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和BAC载体pBeloBAC11的基本功能序列,构建重组病毒转移载体pGAB-gpt-BAC11。通过将pGAB-gpt-BAC11与HVT感染细胞总DNA共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF),待出现病毒噬斑后,利用霉酚酸(MPA)阻断核酸代谢途径,经过筛选获得纯化的重组病毒purified-rHVT。提取purified-rHVT感染细胞总DNA电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,在氯霉素抗性平板上筛选阳性克隆,并用酶切和PCR方法对其进行鉴定。随机选取BAC克隆提取BACDNA转染次代CEF,完成HVT重组病毒的拯救。【结果】经过6轮筛选后获得纯化的重组病毒,并筛选到25个BAC分子克隆化病毒。其中BAC6、BAC8和BAC10再次启动病毒感染,产生与野生型HVT感染CEF相似的病毒噬斑形态,说明已经获得拯救出的HVT重组病毒。【结论】本研究构建了HVT全基因组感染性细菌人工染色体,建立了HVT反向遗传操作技术平台。

关键词：火鸡疱疹病毒病毒拯救细菌人工染色体 BAC分子克隆化病毒

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高致病性PRRS VORF3基因在昆虫细胞中的表达与免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2010年第6期32卷 455-459页

作者：徐明明蔡雪辉刘永刚王淑杰王洪峰石文达李丽琴荣福龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3的结构、功能和免疫学特性,本研究根据GenBank登录的高致病性PRRSV变异株(HP-PRRSV) HuN4株ORF3基因序列,经序列分析去除其N端的一部分疏水性区域(1aa～49aa),设计合成引物。将扩增的基因... 详细信息

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3的结构、功能和免疫学特性,本研究根据GenBank登录的高致病性PRRSV变异株(HP-PRRSV) HuN4株ORF3基因序列,经序列分析去除其N端的一部分疏水性区域(1aa～49aa),设计合成引物。将扩增的基因连接于pFastBac HTb杆状病毒载体中,构建重组质粒pF-ORF3,转化至感受态DH10Bac中,获得重组杆粒rBac-ORF3。再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rAc-ORF3。用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)分析表明GP3在昆虫细胞Sf9中获得正确表达,而且具有良好的反应活性。用纯化的GP3免疫小鼠,制备抗GP3多克隆抗血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其效价。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达了重组GP3,经GP3免疫的小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体,证明表达的GP3具有特异的免疫原性。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF3 杆状病毒表达免疫原性

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五种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其应用

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中国兽医科学 2010年第5期40卷 501-505页

作者：符芳杨玉菊陈微晶张永欣蔡雪辉李曦宋淑萍中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 哈尔滨大学生物学院黑龙江哈尔滨150001

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上,以这5种细胞毒的核酸作为模板,进行不对称PCR扩增,制备靶物,经绿色荧... 详细信息

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上,以这5种细胞毒的核酸作为模板,进行不对称PCR扩增,制备靶物,经绿色荧光染料Cy3标记后,分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交,杂交信号经Genepix 4000A扫描仪扫描。结果显示,该芯片探针可以特异地与Cy3标记的这5种靶物结合。用该基因芯片对100份现地采集的猪全血样品进行检测,检出PRRSV阳性样品26份,PCV-2阳性样品47份,PRRSV和PCV-2混合感染阳性样品17份,PPV阳性样品5份,PRV阳性样品2份,CSFV阳性样品20份。表明,本试验研制的cDNA芯片探针可以特异地检测这5种猪病病毒,具有良好的诊断应用前景。

关键词：基因芯片探针猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型猪细小病毒猪伪狂犬病病毒猪瘟病毒

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果子狸源呼肠孤病毒的分离鉴定

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病毒学报 2008年第5期24卷 376-382页

作者：邵昱昊韩宗玺陈露菲孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江省疾病预防控制中心哈尔滨150030

在广东省采集的果子狸样品共192份,处理后接种Vero-E6细胞,从中分离到1株病毒。该病毒在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。经电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣... 详细信息

在广东省采集的果子狸样品共192份,处理后接种Vero-E6细胞,从中分离到1株病毒。该病毒在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。经电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,呈正二十面体对称,具有呼肠孤病毒的形态特征,将病毒命名为MaskedPal m Civet/China/2004(MPC/04)。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞,不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞,这与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型的红细胞凝集谱相符。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力;能耐受pH3.0的酸性环境;50℃水浴1h病毒未丧失感染能力;1mol/L MgCl2能提高病毒对热的抵抗力。为了进一步从分子水平上证实该病毒是呼肠孤病毒,用哺乳动物呼肠孤病毒特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR),扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBI BLAST比较,选取同源性较高者进行序列同源性分析,发现该片段与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型参考毒株核苷酸同源性最高。以上结果证明该病毒为呼肠孤病毒科的成员。

关键词：果子狸呼肠孤病毒分离鉴定

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鸭β-防御素9(AvBD9)单克隆抗体的制备及鉴定

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农业生物技术学报 2010年第6期18卷 1203-1207页

作者：李子瑞邵昱昊韩宗玺刘晓丽刘胜旺马得莹东北农业大学动物营养研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室

本研究旨在制备抗鸭β-防御素9(AvBD9)蛋白的单克隆抗体。首先用pGEX-6p-1载体表达的鸭AvBD9蛋白做抗原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠(Mus musculus),免疫3次,每次间隔15d,融合前3d加强免疫1次。然后将鸭AvBD9基因亚克隆到原核表达载体pET... 详细信息

本研究旨在制备抗鸭β-防御素9(AvBD9)蛋白的单克隆抗体。首先用pGEX-6p-1载体表达的鸭AvBD9蛋白做抗原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠(Mus musculus),免疫3次,每次间隔15d,融合前3d加强免疫1次。然后将鸭AvBD9基因亚克隆到原核表达载体pET-32a的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET-32a-duckAvBD9,将重组质粒转化至大肠杆菌(Escheriohia coli)BL21(JM83-)株,经IPTG诱导表达、镍柱纯化后做检测原。用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)和Western blot相结合的方法进行筛选及鉴定,经3次亚克隆后得到1株单抗,命名为1F11。结果表明:重组pET-32a-duck AvBD9蛋白大小为26kD,与预期大小一致,并能被抗pGEX-duck AvBD9阳性血清识别。单抗1F11在pGEX-6p-1空载体蛋白、pGEX-duck AvBD9蛋白、pGEX-duck AvBD10蛋白、pGEX-chicken AvBD10蛋白中能够特异性识别pGEX-duckAvBD9蛋白。其亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链。本研究获得了1株鸭AvBD9蛋白的单克隆抗体,单抗1F11的特异性良好,可用于对鸭AvBD9蛋白的生物学功能及活性作进一步研究。

关键词：鸭 pGEX-duck AvBD9 pET-32a-duck AvBD9 单克隆抗体

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猪捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2011年第9期33卷 704-708页

作者：刘杉杉赵亚荣胡峰吕超超胡泉博王贵华崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 大北农动物医学研究中心北京100097

为建立同时检测猪捷申病毒(PTV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重RT-PCR(mRT-PCR)检测方法,本研究以PRRSV ORF6基因、CSFV Erns基因和PTV 5'-UTR基因为对象,建立检测3种病毒的mRT-PCR方法。特异性试验表明,... 详细信息

为建立同时检测猪捷申病毒(PTV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重RT-PCR(mRT-PCR)检测方法,本研究以PRRSV ORF6基因、CSFV Erns基因和PTV 5'-UTR基因为对象,建立检测3种病毒的mRT-PCR方法。特异性试验表明,该方法可以特异扩增3种病毒的基因,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪流感病毒呈阴性反应;敏感性试验表明,PRRSV、CSFV和PTV的最低核酸检出量分别为7.11×102拷贝、7.81×103拷贝和8.43×102拷贝,略低于单一RT-PCR敏感性;应用该方法对69份送检样品进行检测,其中PRRSV、CSFV和PTV单纯感染检出率分别为28.99%、27.54%和56.52%,PRRSV和CSFV混合感染检出率为4.35%,PRRSV和PTV的混合感染检出率为11.59%,CSFV和PTV的混合感染检出率为13.04%,3种病毒的混合感染检出率为8.70%,与单一RT-PCR检测结果符合率为98.6%。本研究建立的检测方法快速简便,可以用于疾病的初步筛选,对临床早期诊断和流行病学调查具有重要意义。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪瘟病毒猪捷申病毒 mRT-PCR

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新城疫病毒复制对其溶瘤作用影响的初步分析

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畜牧兽医学报 2020年第4期51卷 794-800页

作者：吴寒光孙军峰梁雨萌刘胜旺李海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道传染病创新团队哈尔滨150069

本研究旨在明确新城疫病毒(NDV)溶瘤作用是否依赖其复制水平,并改进NDV溶瘤机制研究模型。以NDV疫苗株LaSota感染人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T为研究模型;RT-qPCR检测NDV在各细胞系的基因组复制水平;Western blot检... 详细信息

本研究旨在明确新城疫病毒(NDV)溶瘤作用是否依赖其复制水平,并改进NDV溶瘤机制研究模型。以NDV疫苗株LaSota感染人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T为研究模型;RT-qPCR检测NDV在各细胞系的基因组复制水平;Western blot检测NDV在各细胞系的蛋白表达水平;利用流式细胞术检测NDV感染对各细胞系的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果表明,NDV在三个细胞系内的基因组复制水平和蛋白表达水平没有显著差异,但对三个细胞系的溶瘤作用存在明显差异;进一步流式细胞术检测发现,NDV感染能诱发HEK293T和HCT116的细胞周期发生G1期停滞,但对A549的细胞周期没有明显影响;此外,NDV感染24 h后,A549细胞以早期凋亡为主,而HCT116细胞以坏死/晚期细胞凋亡为主。NDV的溶瘤作用并不依赖于其复制水平,而且NDV对不同类型肿瘤细胞的溶瘤作用存在不同机制。

关键词：新城疫病毒复制溶瘤病毒细胞周期细胞凋亡

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猪细小病毒抗体IPMA检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2011年第4期41卷 387-391页

作者：刘杉杉赵亚荣张超范吕超超胡泉博崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 大北农动物医学研究中心北京100097

建立了一种检测猪细小病毒(PPV)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA),对该方法的反应条件、特异性、敏感性和重复性进行了系统试验,并与HI和ELISA的检测结果进行了比较。结果显示,PPV种毒按照1∶100的剂量接种后第48小时固定效... 详细信息

建立了一种检测猪细小病毒(PPV)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA),对该方法的反应条件、特异性、敏感性和重复性进行了系统试验,并与HI和ELISA的检测结果进行了比较。结果显示,PPV种毒按照1∶100的剂量接种后第48小时固定效果最佳,辣根过氧化物酶-葡萄球菌A蛋白标记物的最适稀释度为1∶1 000,待检血清最适稀释度为1∶100。该IPMA方法与PCV2、PRV、PRRSV和CSFV的参考血清无交叉反应;PPV阳性血清稀释至1∶1 600时仍能检出;批内和批间重复性试验表明,该方法具有良好的重复性。符合性试验结果表明,该IPMA方法与HI和ELISA的符合率分别为96.0%与98.0%。用建立的IPMA方法检测PPV灭活疫苗免疫猪,结果免疫后第2周开始阳转,5周后全部阳转。对现地送检的400份猪血清样本进行检测,结果平均检出阳性率为86.5%。该IPMA方法的建立使PPV的血清学快速检测成为可能,可以用此方法开展PPV的抗体流行病学普查。

关键词：猪细小病毒免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测

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高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒感染猪外周血单核细胞cDNA文库的构建

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中国兽医科学 2009年第8期39卷 669-673页

作者：肖晶符芳李海忠张永欣柴政蔡雪辉宋淑萍李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

为应用CloneminerTMcDNA Library Construction Kit构建高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪的外周血单核细胞cDNA文库,以1×105TCID50PRRSV肌肉接种健康猪,攻毒后第3、5、7、9、14、21及28 d分别采集感染猪外周血,分离单... 详细信息

为应用CloneminerTMcDNA Library Construction Kit构建高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪的外周血单核细胞cDNA文库,以1×105TCID50PRRSV肌肉接种健康猪,攻毒后第3、5、7、9、14、21及28 d分别采集感染猪外周血,分离单核细胞,提取总RNA、mRNA,以mRNA为模板,通过引物Biotin-attB2-Oligo(dT)、SuperScript.ⅡRT合成5′末端具有attB1接头的cDNA。用柱层析方法纯化cDNA,纯化后的cDNA与pDONRTM222载体进行BP重组,于大肠杆菌DH10B转化,进行文库容量测定。结果表明,构建的高致病性PRRSV感染猪外周血单核细胞cDNA文库的库容量为1.36×107CFU,平均插入片段长度大于1 200 bp,重组率为94.3%,为进一步从文库中筛选未知细胞因子及相关基因提供了有效的工具。

关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒外周血单核细胞 cDNA文库

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PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗免疫特性的研究

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中国预防兽医学报 2010年第6期32卷 468-472页

作者：李丽琴蔡雪辉刘永刚王淑杰石文达徐敏荣福龙武佳斌徐明明田志军胡守萍中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150001

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株疫苗的免疫机理和明确PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗各自的免疫特性,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫PRRSV抗原和抗体阴性的健康断奶仔猪,免疫后21... 详细信息

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株疫苗的免疫机理和明确PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗各自的免疫特性,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫PRRSV抗原和抗体阴性的健康断奶仔猪,免疫后21d用PRRSV变异株HuN4强毒攻毒,ELISA方法检测血清中PRRSV特异的抗体水平及TNF-α、IFN-α、IL-1、IL-6和CRP细胞因子水平,荧光定量RT-PCR方法检测病毒血症的发生和持续情况,并取主要器官进行病理组织学观察。结果表明:HuN4活疫苗组免疫后14d便可检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d各细胞因子水平升高,攻毒后21d病毒血症完全消失,免疫后各器官没有明显病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化轻微;JXA1株灭活苗组免疫期间没有检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d～9d各细胞因子水平升高,攻毒后病毒血症持续存在,免疫后各器官有轻微病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化比HuN4活疫苗组严重,但比对照组明显减轻。本实验表明,HuN4活疫苗能够快速有效的激发机体的体液免疫反应,在抵抗PRRSV变异株HuN4强毒攻毒时,临床症状明显优于JXA1灭活苗。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征 PRRSV变异株(HuN4)活疫苗 PRRSV变异株(JXA1)灭活苗

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