检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学通报 2011年第11期38卷 1688-1697页

作者：张可心蔺利娟韩宗玺邵昱昊刘胜旺马得莹东北农业大学动物营养研究所黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为克隆与表达鸭β-防御素5(AvBD5)基因及测定其生物学特性,采用RT-PCR方法从鸭肺脏组织中扩增到鸭AvBD5,将测得的序列与已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树进行同源性分析。结果显示鸭AvBD5 cDNA大小... 详细信息

为克隆与表达鸭β-防御素5(AvBD5)基因及测定其生物学特性,采用RT-PCR方法从鸭肺脏组织中扩增到鸭AvBD5,将测得的序列与已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树进行同源性分析。结果显示鸭AvBD5 cDNA大小为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基,分别在分子内形成Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6共3对二硫键,与鸡AvBD5氨基酸同源性高达97%。进一步将其亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。重组GST融合蛋白经纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响,以及该重组GST融合蛋白对溶血活性的影响。鸭AvBD5重组蛋白分子量约为32 kD,具有良好的抗菌活性,对11种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性有一定影响。此外,该重组蛋白对红细胞溶血活性极低。

关键词：鸭AvBD5 重组蛋白抗菌活性

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马传染性贫血病毒弱毒株LTR点突变型嵌合感染性克隆的构建

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中国预防兽医学报 2007年第8期29卷 569-574页

作者：左咏梅吕晓玲赵立平李庆章郝艳红沈荣显相文华王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)长末端重复序列(Long terminal repeat,LTR)是基因组中高度变异区之一,EIAV LTR的变异对于指导病毒的复制和病毒致病性具有重要的生物学意义。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒... 详细信息

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)长末端重复序列(Long terminal repeat,LTR)是基因组中高度变异区之一,EIAV LTR的变异对于指导病毒的复制和病毒致病性具有重要的生物学意义。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,由马传贫强毒至弱毒致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,以驴胎皮肤弱毒株疫苗全长感染性克隆pLGFD3-8为父本,选取LTR R区的TAR起始碱基,poly(A)附加位点,采用反向遗传操作对其位点进行PCR体外定点突变,将弱毒序列构建的逆向点突变型全基因克隆转染到驴胎皮肤细胞(FDD)并在FDD上传代,通过逆转录酶活性(RT)检测、RT-PCR方法及real-time RT PCR检测并验证其感染性。检测结果为构建的逆向点突变型感染性克隆在FDD上被拯救,其衍生病毒感染的FDD上出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性;电镜下可见大量典型的EIAV颗粒pLGFD-M点突变型嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8复制水平相似。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。

关键词：马传染性贫血病毒定点突变嵌合病毒

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牛溶血性曼氏杆菌白细胞毒素、脂蛋白E和外膜蛋白A的免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2021年第7期43卷 753-758页

作者：李奕欣姜志刚于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

在应激条件下,溶血性曼氏杆菌(Mh)能够引起牛的纤维素性肺炎或胸膜肺炎,对全球养牛业危害严重,免疫接种是防控Mh病的主要手段。为了评价牛源A1型Mh脂蛋白E(PlpE)、外膜蛋白A(OmpA)以及白细胞毒素(LKT)的免疫原性,本研究分别将PlpE、Omp... 详细信息

在应激条件下,溶血性曼氏杆菌(Mh)能够引起牛的纤维素性肺炎或胸膜肺炎,对全球养牛业危害严重,免疫接种是防控Mh病的主要手段。为了评价牛源A1型Mh脂蛋白E(PlpE)、外膜蛋白A(OmpA)以及白细胞毒素(LKT)的免疫原性,本研究分别将PlpE、OmpA以及LKT的毒力效应蛋白LKTA的编码基因克隆至原核表达载体pET-28a,并在大肠杆菌中表达,采用亲和层析或电洗脱的方法对重组蛋白进行提纯。将纯化的重组蛋白rPlpE、r OmpA和rLKTA分别或组合接种BALB/c小鼠,首次免疫14 d后采用相同方法加强免疫,分别于首次免疫后14 d、21 d、28 d和35 d采集小鼠血清。采用间接ELISA方法检测小鼠血清中针对Mh的特异性IgG抗体水平,结果显示各重组蛋白均能够诱导小鼠产生针对Mh的特异性IgG抗体,而rPlpE和rLKTA诱导的抗体水平明显高于r OmpA。采用牛淋巴细胞中和试验检测rLKTA免疫小鼠血清中针对LKT的中和抗体水平,结果显示rLKTA能够诱导小鼠产生高水平的中和抗体,二免后21 d小鼠血清中的平均中和抗体滴度可达363。以致死剂量的A1型Mh菌液对免疫小鼠进行攻击,结果显示rPlpE对小鼠的保护率为50%(2/4),而rOmpA对小鼠无保护作用。综上所述,r LKTA和r PlpE能够诱导小鼠产生针对Mh的保护性免疫应答,是A1型Mh的优势保护性免疫原组分,本研究为全面了解牛源A1型Mh主要免疫保护性抗原以及Mh新型疫苗的研究奠定了实验基础。

关键词：牛溶血性曼氏杆菌白细胞毒素脂蛋白E 外膜蛋白A 免疫原性

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同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立

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畜牧兽医学报 2009年第1期40卷 72-77页

作者：成丹赵建军李娜孙元周艳君朱妍田志军涂长春童光志仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学院乌鲁木齐830052 军事医学科学院军事兽医研究所长春130062

应用猪瘟病毒(CSFV)及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特异性引物和TaqMan水解探针,建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT-PCR方法。该方法可检测到3.2 TCID50的CSFV和1.8TCID50的北美洲型PRRSV,比常规PCR方法敏感性高5... 详细信息

应用猪瘟病毒(CSFV)及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特异性引物和TaqMan水解探针,建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT-PCR方法。该方法可检测到3.2 TCID50的CSFV和1.8TCID50的北美洲型PRRSV,比常规PCR方法敏感性高50倍以上。用复合荧光定量RT-PCR方法对155份现地样品进行检测,结果73份为PRRSV阳性,16份为CSFV阳性,13份为CSFV和PRRSV混合感染,与常规RT-PCR的符合率高达99.4%。该复合荧光定量RT-PCR方法敏感、特异、重复性好。

关键词：猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒复合荧光定量RT—PCR

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荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系

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中国预防兽医学报 2011年第9期33卷 699-703页

作者：葛叶张兴娟朱庆虎韩秋影王牟平李伟杰孙建宏仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科生物技术开发公司黑龙江哈尔滨150069

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测。结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低... 详细信息

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测。结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低105个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应,最低103个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应。荧光定量RT-PCR检测方法的检测过程仅需3.5 h,大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间,该方法可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验。

关键词：猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR 兔体定型热试验

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应用Gelatin和3D培养验证细胞粘附对传染性支气管炎病毒在体外培养细胞中增殖的影响

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中国预防兽医学报 2018年第12期40卷 1089-1094页

作者：王娜娜韩宗玺山丹邵昱昊刘胜旺李海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069

除传染性支气管炎病毒(IBV) Beaudette株外,其它IBV均难以在体外细胞系中传代培养。为研究限制IBV体外传代培养的影响因素,本研究应用流式细胞术检测IBV经典株M41囊膜与宿主细胞膜融合程度,结果显示M41可以在体外培养条件下侵入鸡细胞系... 详细信息

除传染性支气管炎病毒(IBV) Beaudette株外,其它IBV均难以在体外细胞系中传代培养。为研究限制IBV体外传代培养的影响因素,本研究应用流式细胞术检测IBV经典株M41囊膜与宿主细胞膜融合程度,结果显示M41可以在体外培养条件下侵入鸡细胞系LMH和DF-1,但荧光定量PCR检测显示侵入的M41无法增殖。进一步通过对比分析M41易感组织气管、非易感组织脾脏及LMH细胞全基因组转录谱数据,结果显示宿主细胞粘附、细胞周期、p53及SRC可能是M41在体外培养细胞中增殖的宿主决定因素。本研究通过在2D培养体系中预先孵育Gelatin和3D培养两种方式来调节细胞粘附的物理环境,结果显示两种方法均可以促进M41在体外培养细胞中的增殖;利用多种经典的细胞周期抑制剂及p53和SRC活性调控分子预先处理LMH和DF1,显示细胞周期、p53活性及SRC活性对IBV体外增殖无显著影响。表明细胞粘附特性是影响IBV体外增殖的重要因素。本研究为IBV体外细胞培养体系的建立奠定了实验基础。

关键词：传染性支气管炎病毒全基因组转录谱分析病毒增殖 3D细胞培养

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犬蝠源呼肠病毒的分离与鉴定

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中国农业科学 2007年第8期40卷 1795-1801页

作者：冉旭华邵昱昊韩宗玺陈露菲孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江省疾病预防控制中心

【目的】从野生蝙蝠体内分离病毒,为开展蝙蝠的病原监测奠定基础。【方法】从广东省韶关采集了30份野生犬蝠样品,研磨后接种Vero E6细胞,从中分离到2株病毒,对其中一株病毒进行研究,使用生物学与分子生物学方法确定其分类学地位。【结... 详细信息

【目的】从野生蝙蝠体内分离病毒,为开展蝙蝠的病原监测奠定基础。【方法】从广东省韶关采集了30份野生犬蝠样品,研磨后接种Vero E6细胞,从中分离到2株病毒,对其中一株病毒进行研究,使用生物学与分子生物学方法确定其分类学地位。【结果】该毒株在Vero E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。反复冻融3次后,收集细胞及培养液,电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,呈正二十面体对称,将病毒命名为Bat/China/2003(B/03)。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞,不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力、能耐受pH3.0的酸性环境、50℃水浴1h病毒丧失感染能力、1mol·L-1MgCl2能提高病毒对热的抵抗力。病毒基因组经琼脂糖凝胶电泳分大、中、小3个区段。用哺乳动物呼肠病毒特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBI BLAST分析表明,与呼肠病毒科正呼肠病毒属的Ndelle virus核苷酸同源性最高为91.2%。用DNAMAN Multiple Alignment进行序列同源性分析,与哺乳动物呼肠病毒血清1、2、3型的代表株T1L,T2J,T3D的核苷酸同源性分别为89.9%、76.9%、89.9%。【结论】由以上结果推断该病毒为呼肠病毒科的成员。

关键词：犬蝠呼肠病毒分离鉴定

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波形蛋白与猪瘟病毒衣壳蛋白定位分析

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中国预防兽医学报 2014年第9期36卷 740-742页

作者：张鑫时洪艳徐佳赵鑫中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江省动物卫生监督所黑龙江哈尔滨150069

为了解波形蛋白在ST细胞中的定位及其与猪瘟病毒(CSFV)衣壳蛋白(C)的共定位关系,本研究采用抗体对波形蛋白的细胞定位进行检测,并将CSFV C蛋白真核表达重组质粒转染于ST细胞中,转染12 h和24 h后利用激光共聚焦显微镜观察波形蛋白和CSFV ... 详细信息

为了解波形蛋白在ST细胞中的定位及其与猪瘟病毒(CSFV)衣壳蛋白(C)的共定位关系,本研究采用抗体对波形蛋白的细胞定位进行检测,并将CSFV C蛋白真核表达重组质粒转染于ST细胞中,转染12 h和24 h后利用激光共聚焦显微镜观察波形蛋白和CSFV C蛋白在细胞中的定位情况。结果表明,波形蛋白在细胞核周围定位,并且与CSFV C蛋白在细胞中存在共定位现象。本研究为进一步研究波形蛋白在病毒复制过程中的机制奠定基础。

关键词：波形蛋白猪瘟病毒衣壳蛋白共定位

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猪瘟病毒衣壳蛋白核仁定位信号鉴定

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中国预防兽医学报 2015年第2期37卷 93-96页

作者：张鑫刘宁时洪艳徐佳中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江省动物卫生监督所黑龙江哈尔滨150069

为鉴定猪瘟病毒(CSFV)衣壳蛋白(C)在细胞中的核仁定位信号(No LS),本研究采用截短表达的方法将含有C基因不同片段的真核表达重组质粒转染猪睾丸细胞(ST)。结果表明,瞬时表达的截短C蛋白的aa51-aa71多肽定位于ST细胞核仁中。而将C蛋白的a... 详细信息

为鉴定猪瘟病毒(CSFV)衣壳蛋白(C)在细胞中的核仁定位信号(No LS),本研究采用截短表达的方法将含有C基因不同片段的真核表达重组质粒转染猪睾丸细胞(ST)。结果表明,瞬时表达的截短C蛋白的aa51-aa71多肽定位于ST细胞核仁中。而将C蛋白的aa51-aa71缺失突变后,C蛋白则丧失了其核仁定位的能力。此外,将C蛋白的51KKK53突变为51AAA53,也同样导致C蛋白丧失核仁定位能力,表明该序列为核仁定位的核心基序。本研究为进一步分析C蛋白在CSFV复制过程中的功能提供了实验依据。

关键词：猪瘟病毒衣壳蛋白核仁定位信号

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鸡法氏囊B淋巴细胞三框cDNA表达文库的构建

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中国预防兽医学报 2008年第1期30卷 10-13页

作者：高玉龙刘伟高宏雷邓小芸李铁强王笑梅沈荣显中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

分离纯化3周龄SPF鸡法氏囊B淋巴细胞的mRNA,以5'端生物素标记的Oligo(dT)primer为引物反转录后连接3种读码框的Adapter,层析柱分级纯化,通过BP重组反应分别构建3种读码框的cDNA入门文库,平均滴度分别为1×105CFU/mL、1×105... 详细信息

分离纯化3周龄SPF鸡法氏囊B淋巴细胞的mRNA,以5'端生物素标记的Oligo(dT)primer为引物反转录后连接3种读码框的Adapter,层析柱分级纯化,通过BP重组反应分别构建3种读码框的cDNA入门文库,平均滴度分别为1×105CFU/mL、1×105CFU/mL、1.2×105CFU/mL,文库总容量分别为1.2×106CFU、1.2×106CFU、1.5×106CFU,平均插入片段分别为1270bp、1190bp和1120bp,阳性重组率均为100%。将3种读码框的cDNA入门文库扩增后提取质粒,取等量的质粒通过LR重组反应将入门文库转换为三框表达文库,经测定平均滴度为1×105CFU/mL,文库总容量为1.2×106CFU,平均插入片段为1017bp,阳性重组率为100%。结果表明所构建的三框cDNA表达文库具有较高的重组率和较大的库容量,为进一步筛选鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)在法氏囊B淋巴细胞中的受体及研究细胞嗜性奠定了基础。

关键词：三框cDNA文库 cDNA表达文库法氏囊 B淋巴细胞传染性法氏囊病毒(IBDV)

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